نيو إنجلاند بيولابس، P0743S، نيورامينيداز α2-3 S

إنزيم α2-3 نيورامينيداز S هو إنزيم إكسوغليكوزيداز عالي التخصص يحفز تحلل α2-3 المرتبط . الفئات ذات الصلة : إنزيمات إكسوغليكوزيداز. التطبيقات: أنظمة التعبير، تسلسل الغليكان، هضم البروتين. تعريف الوحدة: تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لفصل أكثر من 95% من α-Neu5Ac الطرفي من 1 نانومول من Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc-AMC، في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X، حضانة عند 37 درجة مئوية. محلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X، 5 ملي مولار كلوريد الكالسيوم، 50 ملي مولار أسيتات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 5.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين : 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 20 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 1 ملي مولار إيديتات ثنائي الصوديوم (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). التثبيط الحراري : 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي الظاهري: 74 كيلو دالتون. النشاط النوعي : 160,000 وحدة/ملغ . شروط قياس الوحدة: يتم تحضين تخفيفات متسلسلة من نيورامينيداز α2-3 S مع 1 نانومول من الركيزة الموسومة بـ AMC ومحلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X في تفاعل حجمه 10 ميكرولتر. يتم تحضين مزيج التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. يتم تصوير فصل نواتج التفاعل باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (1). الأسئلة الشائعة : س: ما هي الجليكوسيدازات وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم الجليكوسيدازات للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات السكرية والببتيدات السكرية. وهي نوعان: إندوجليكوسيدازات التي تفصل مجموعات الكربوهيدرات الكاملة عن البروتينات، وإكسوجليكوسيدازات التي تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المختزلة للكربوهيدرات. أما النهاية المختزلة فهي تلك التي يُنتجها الإندوجليكوسيداز. غالبًا ما يستخدم الباحثون إندوجليكوسيداز متبوعًا بواحد أو أكثر من الإكسوجليكوسيدازات، ثم يحللون النواتج باستخدام SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من الكروماتوغرافيا السائلة. س: ما الفرق بين إنزيمات النيورامينيداز الأربعة التي تُباع من قِبل شركة NEB: نيورامينيداز α2-3,6,8، ونيورامينيداز α2-3,6,8,9 A، ونيورامينيداز α2-3، ونيورامينيداز α2-3 S؟ إنزيم نيورامينيداز α2-3,6,8 (NEB# P0720) مستنسخ من بكتيريا كلوستريديوم بيرفرينجنز، ويقوم بفصل بقايا حمض السياليك المرتبطة بروابط α2-3 و α2-6 و α2-8. أما إنزيم نيورامينيداز α2-3,6,8,9 A (NEB# P0722) فهو مستنسخ من بكتيريا أرثروباكتر يوريافاسينز، ويقوم بفصل بقايا حمض السياليك المرتبطة بروابط α2-3 و α2-6 و α2-8 و α2-9. كما يمكنه فصل بقايا حمض السياليك المتفرعة المرتبطة ببقايا داخلية. أما إنزيم نيورامينيداز α2-3 (NEB# P0728) فهو مستنسخ من بكتيريا السالمونيلا التيفية LT2، ويقوم بفصل بقايا حمض السياليك المرتبطة بروابط α2-3. إنزيم نيورامينيداز α2-3 S (NEB# P0743) مستنسخ من بكتيريا المكورات الرئوية، ويقوم بفصل بقايا حمض السياليك المرتبطة بروابط α2-3. س: هل يمكنني استخدام إنزيم نيورامينيداز α2-3 S في عملية هضم مزدوجة مع إنزيمات إكسوغليكوزيداز و/أو إندوغليكوزيداز أخرى؟ ج: نعم. نوصي بإجراء عملية هضم مزدوجة لإنزيم نيورامينيداز α2-3 S مع إنزيمات إكسوغليكوزيداز أخرى باستخدام محلول غليكوبفر 1 (50 ملي مولار أسيتات الصوديوم، درجة الحموضة 5.5، 5 ملي مولار كلوريد الكالسيوم). كما نوصي باستخدام محلول تفاعل G7 (50 ملي مولار فوسفات الصوديوم، درجة الحموضة 7.5) لهضم إنزيم نيورامينيداز α2-3 S باستخدام إنزيم PNGase F و/أو إنزيم O-غليكوزيداز. س: ما هو عنصر التحكم الإيجابي المناسب لإنزيم نيورامينيداز α2-3 S؟ ج: فيتوين (NEB# P6042) أو حمض pNP-N-أسيتيل-نيورامينيك. يحتوي الفيتوين على بقايا حمض سياليك طرفية من نوع α2-3 و α2-6؛ يقوم نيورامينيداز α2-3 S بفصل البقايا المرتبطة برابطة α2-3 فقط، وبالتالي سيكون التغير في الوزن الجزيئي (نتيجة فقدان حمض السياليك) متوسطًا مقارنةً بالمعالجة باستخدام نيورامينيداز عام. س: هل يتطلب هذا الإنزيم ظروفًا مُفسِّخة للعمل على البروتينات السكرية؟ ج: لا، بشكل عام، تستطيع الإكسوغليكوزيدازات إزالة بقايا السكر من البروتينات السكرية الأصلية (المطوية) (حيث تكون السكريات المحبة للماء بعيدة عن العمود الفقري للبروتين). ومع ذلك، قد يؤثر طي البروتين حول موقع السكريات على إمكانية وصول الإنزيم. يتطلب هضم بعض البروتينات بواسطة الإكسوغليكوزيداز فترات حضانة أطول، أو في بعض الحالات درجة معتدلة من التفسُّخ. س: ما هي أفضل طريقة لإعادة تنقية الغليكان أو الغليكوبروتين بعد المعالجة بالإكسوغليكوزيداز؟ ج: الترشيح باستخدام مرشحات دقيقة دوارة، أو الاستخلاص الطوري الصلب (على سبيل المثال: خراطيش الكربون المُجرافيت). س: هل تُثبّط المنظفات عمل الجليكوزيداز؟ ج: عند مستويات معتدلة (0.5-1.0% من المنظفات الأيونية وغير الأيونية)، تُظهر معظم الجليكوزيداز نشاطًا مُرضيًا أو لا تتأثر. تشمل الاستثناءات PNGase F، وPNGase F المُعاد تركيبه، وRemove-iT PNGase F، وO-Glycosidase التي تُثبّطها SDS. س: هل تقوم إنزيمات NEB Neuraminidase بفصل كل من بقايا حمض N-acetylneuraminic (Neu5Ac) وحمض N-glycolylneuraminic (Neu5Gc)؟ ج: اعتمادًا على مصدر الإنزيم ونوعيته، تقوم بعض إنزيمات النيورامينيداز بتحليل كل من Neu5Ac وNeu5Gc، بينما يقوم بعضها الآخر بتحليل Neu5Ac فقط. وتميل تلك التي تحلل كليهما إلى أن تكون أقل كفاءة تجاه Neu5Gc. NEB# P0720 (نيورامينيداز α2-3,6,8) - يحلل كل من Neu5Ac وNeu5Gc. NEB# P0722 (نيورامينيداز α2-3,6,8,9 A) - يحلل كل من Neu5Ac وNeu5Gc. NEB# P0743 (نيورامينيداز α2-3 S) - يحلل Neu5Ac فقط. س: ما هي كمية الإكسوغليكوزيداز التي يجب استخدامها؟ ج: تختلف كمية الإنزيم المطلوبة باختلاف الركائز المستخدمة. ابدأ بـ 1-2 ميكرولتر لكل 1 ميكروغرام من البروتين السكري أو 100 نانومول من السكريات قليلة الوحدات لمدة ساعة واحدة في تفاعل حجمه 10-25 ميكرولتر. إذا بقيت مواد غير مهضومة، اترك التفاعل طوال الليل.