نيو إنجلاند بيولابس، P0744S، بيتا-إن-أسيتيل جلوكوزامينيداز إس

إنزيم β-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز S هو إنزيم خارجي يحفز تحلل بقايا β-N-أسيتيل جلوكوزامين الطرفية غير المختزلة من السكريات قليلة الوحدات. التصنيفات ذات الصلة : الإكسوجليكوزيدازات، تطبيقات تحليل البروتينات، أنظمة التعبير، هضم البروتين، التعبير عن البروتينات السكرية المؤتلفة. تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لفصل أكثر من 95% من β-N-أسيتيل جلوكوزامين الطرفي غير المختزل من 1 نانومول من GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-7-أمينو-4-ميثيل كومارين (AMC)، خلال ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول غليكوبافر 1 بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول غليكوبافر 1 بتركيز 1X، 5 ملي مولار كلوريد الكالسيوم، 50 ملي مولار أسيتات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 5.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 20 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 1 ملي مولار إيدتا، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : لا. الوزن الجزيئي الظاهري: 125 كيلو دالتون. شروط فحص الوحدة: يتم تحضين تخفيفات متسلسلة من β-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز S مع 1 نانومول من الركيزة الموسومة بـ AMC ومحلول غليكوبافر 1 بتركيز 1X في تفاعل حجمه 10 ميكرولتر. يُحضن مزيج التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. يتم تصوير فصل نواتج التفاعل باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (1). الأسئلة الشائعة : س: ما هي الجليكوسيدازات وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم الجليكوسيدازات للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات السكرية والببتيدات السكرية. وهي نوعان: إندوجليكوسيدازات التي تفصل مجموعات الكربوهيدرات الكاملة عن البروتينات، وإكسوجليكوسيدازات التي تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المختزلة للكربوهيدرات. أما النهاية المختزلة فهي تلك التي يُنتجها الإندوجليكوسيداز. غالبًا ما يستخدم الباحثون إندوجليكوسيداز متبوعًا بواحد أو أكثر من الإكسوجليكوسيدازات، ثم يحللون النواتج باستخدام SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من الكروماتوغرافيا السائلة. س: ما الفرق بين β-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز وβ-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز S (NEB# P0744)؟ ج: تم استنساخ β-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز من بكتيريا Xanthomonas manihotis؛ بينما يُستنسخ إنزيم β-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز S (NEB# P0744) من بكتيريا المكورات الرئوية. كلا الإنزيمين يقطعان بقايا N-أسيتيل جلوكوزامين المرتبطة بروابط β1-2,3,4,6. يحتوي كلا الإنزيمين على نفس تركيز الوحدة. يتميز إنزيم β-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز S (NEB# P0744) بقدرته على قطع بقايا β-N-أسيتيل جلوكوزامين الثنائية بكفاءة. س: هل يمكنني استخدام إنزيم β-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز S في مزيج مع إنزيم Endo H/Hf أو PNGase F؟ ج: نعم. س: ما هو عنصر التحكم الإيجابي المناسب لإنزيم β-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز S؟ ج: pNP-GlcNAc س: هل يمكنني استخدام β-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز S في عملية هضم مزدوجة مع إنزيمات إكسوغليكوزيداز و/أو إندوغليكوزيداز أخرى؟ ج: نعم. نوصي بإجراء عملية هضم مزدوجة لـ β-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز S مع إنزيمات إكسوغليكوزيداز أخرى باستخدام محلول غليكوبفر 1 (50 مليمولار أسيتات الصوديوم، درجة الحموضة 5.5، 5 مليمولار كلوريد الكالسيوم). كما نوصي باستخدام محلول تفاعل G7 (50 مليمولار فوسفات الصوديوم، درجة الحموضة 7.5) لهضم β-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز S مع إنزيم PNGase F و/أو O-غليكوزيداز. س: هل يتطلب هذا الإنزيم ظروفًا مُفسِّخة ليعمل على البروتينات السكرية؟ ج: لا، بشكل عام، تستطيع الإكسوغليكوزيدازات إزالة بقايا السكر من البروتينات السكرية الأصلية (المطوية) (حيث تتجه السكريات المحبة للماء بعيدًا عن هيكل البروتين). مع ذلك، قد يؤثر طي البروتين حول موقع السكري على إمكانية وصول الإنزيم. يتطلب هضم بعض البروتينات بواسطة الإكسوغليكوزيداز فترات حضانة أطول، أو في بعض الحالات درجة طفيفة من التمسخ. س: ما هي الطريقة المثلى لإعادة تنقية السكريات أو الببتيدات السكرية بعد معالجتها بالإكسوغليكوزيداز؟ ج: الترشيح باستخدام مرشحات دقيقة، أو الاستخلاص الطوري الصلب (على سبيل المثال: خراطيش الكربون الجرافيتي). س: هل تثبط المنظفات عمل الجليكوزيدازات؟ ج: عند مستويات معتدلة (0.5-1.0% من المنظفات الأيونية وغير الأيونية)، تُظهر معظم الجليكوزيدازات نشاطًا مُرضيًا أو لا تتأثر. تشمل الاستثناءات إنزيم PNGase F، وإنزيم PNGase F المؤتلف، وإنزيم Remove-iT PNGase F، وإنزيم O-Glycosidase، حيث يتم تثبيطها بواسطة SDS. س: ما هي كمية الإكسوغليكوزيداز اللازمة؟ ج: تختلف كمية الإنزيم المطلوبة باختلاف الركائز المستخدمة. ابدأ بـ 1-2 ميكرولتر لكل 1 ميكروغرام من البروتين السكري أو 100 نانومول من السكريات قليلة الوحدات لمدة ساعة واحدة في تفاعل حجمه 10-25 ميكرولتر. إذا بقيت مواد غير مهضومة، اترك التفاعل طوال الليل.