نيو إنجلاند بيولابس، P0745S، β1-4 جالاكتوزيداز S

إنزيم β1-4 غالاكتوزيداز S هو إنزيم إكسوغليكوزيداز عالي التخصص، يحفز تحلل بقايا الغالاكتوز الطرفية غير المختزلة المرتبطة بروابط β1-4 من السكريات قليلة الوحدات. التصنيفات ذات الصلة : تطبيقات الإكسوغليكوزيداز، أنظمة التعبير، تسلسل الغليكان، هضم البروتين. تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لفصل أكثر من 95% من β-D-غالاكتوز الطرفي من 1 نانومول من Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc-7-أمينو-4-ميثيل-كومارين (AMC) خلال ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X، حضانة عند 37 درجة مئوية. محلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X، 5 ملي مولار كلوريد الكالسيوم، 50 ملي مولار أسيتات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 5.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين : 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 20 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 1 ملي مولار إيديتات ثنائي الصوديوم (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). التثبيط الحراري : 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي الظاهري: 231 كيلو دالتون. النشاط النوعي : 123000 وحدة/ملغ . شروط قياس الوحدة: يتم تحضين تخفيفات متسلسلة من β1-4 جالاكتوزيداز S مع 1 نانومول من الركيزة الموسومة بـ AMC ومحلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X في تفاعل حجمه 10 ميكرولتر. يتم تحضين مزيج التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. يتم تصوير فصل نواتج التفاعل باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (1). الأسئلة الشائعة : س: ما هي الجليكوسيدازات وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم الجليكوسيدازات للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات السكرية والببتيدات السكرية. وهي نوعان: إندوجليكوسيدازات التي تفصل مجموعات الكربوهيدرات الكاملة عن البروتينات، وإكسوجليكوسيدازات التي تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المختزلة للكربوهيدرات. أما النهاية المختزلة فهي تلك التي ينتجها الإندوجليكوسيداز. غالبًا ما يستخدم الباحثون إندوجليكوسيداز متبوعًا بواحد أو أكثر من الإكسوجليكوسيدازات، ثم يحللون النواتج باستخدام SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من الكروماتوغرافيا السائلة. س: ما الفرق بين β1–4 جالاكتوزيداز وβ1–4 جالاكتوزيداز S؟ ج: تم استنساخ β1–4 جالاكتوزيداز (NEB# P0730) من بكتيريا Bacteroides fragilis؛ بينما يُستنسخ إنزيم β1–4 Galactosidase S (NEB# P0745) من بكتيريا Streptococcus pneumoniae. كلا الإنزيمين يقطعان بقايا الجالاكتوز المرتبطة برابطة β1–4. يتمتع كلا الإنزيمين بنفس النشاط والنوعية والتركيز. س: ما الفرق بين β1–4 Galactosidase S و β1–3 Galactosidase؟ ج: يقطع β1–4 Galactosidase S بقايا الجالاكتوز المرتبطة برابطة جليكوسيدية β1–4 فقط، بينما يقطع β1–3 Galactosidase بقايا الجالاكتوز المرتبطة بروابط β1–3، وبكفاءة أقل، بروابط β1–6. س: ما هو عنصر التحكم الإيجابي المناسب لـ β1–4 Galactosidase S؟ ج: pNP-βGal (4-نيتروفينيل-β-D-غالاكتوبيرانوزيد) س: هل يمكنني استخدام β1–4 غالاكتوزيداز S في عملية هضم مزدوجة مع إنزيمات إكسوغليكوزيداز و/أو إندوغليكوزيداز أخرى؟ ج: نعم. نوصي بإجراء عملية هضم مزدوجة لـ β1–4 غالاكتوزيداز S مع إنزيمات إكسوغليكوزيداز أخرى باستخدام محلول غليكوبفر 1 (50 مليمولار أسيتات الصوديوم، درجة الحموضة 5.5، 5 مليمولار كلوريد الكالسيوم). كما نوصي باستخدام محلول تفاعل G7 (50 مليمولار فوسفات الصوديوم، درجة الحموضة 7.5) لهضم β1–4 غالاكتوزيداز S باستخدام إنزيم PNGase F و/أو O-غليكوزيداز. س: هل يتطلب هذا الإنزيم ظروفًا مُفسِّخة ليعمل على البروتينات السكرية؟ ج: لا، بشكل عام، تستطيع الإكسوغليكوزيدازات إزالة بقايا السكر من البروتينات السكرية الأصلية (المطوية) (حيث تتجه السكريات المحبة للماء بعيدًا عن هيكل البروتين). مع ذلك، قد يؤثر طي البروتين حول موقع السكري على إمكانية وصول الإنزيم. يتطلب هضم بعض البروتينات بواسطة الإكسوغليكوزيداز فترات حضانة أطول، أو في بعض الحالات درجة طفيفة من التمسخ. س: ما هي الطريقة المثلى لإعادة تنقية السكريات أو الببتيدات السكرية بعد معالجتها بالإكسوغليكوزيداز؟ ج: الترشيح باستخدام مرشحات دقيقة، أو الاستخلاص الطوري الصلب (على سبيل المثال: خراطيش الكربون الجرافيتي). س: هل تثبط المنظفات عمل الجليكوزيدازات؟ ج: عند مستويات معتدلة (0.5-1.0% من المنظفات الأيونية وغير الأيونية)، تُظهر معظم الجليكوزيدازات نشاطًا مُرضيًا أو لا تتأثر. تشمل الاستثناءات إنزيم PNGase F، وإنزيم PNGase F المؤتلف، وإنزيم Remove-iT PNGase F، وإنزيم O-Glycosidase، حيث يتم تثبيطها بواسطة SDS. س: ما الإنزيم الذي يجب استخدامه لإزالة بقايا الجالاكتوز المرتبطة بروابط β1-4 من IgG السليم؟ ج: قد يصعب إزالة بقايا الجالاكتوز المرتبطة بروابط β1-4 من IgG السليم في الظروف الطبيعية، ويختلف النشاط بشكل كبير اعتمادًا على النوع الفرعي من IgG. عادةً ما تكون هناك حاجة إلى فترات حضانة مطولة ووحدات متزايدة لرؤية معدل تحول الركيزة. يُعد إنزيم β1-4 Galactosidase S (NEB #P0745) هو الإنزيم المفضل لهذا الغرض، حيث أن إنزيم β1-4 Galactosidase (NEB #P0730) لديه نشاط منخفض جدًا على IgG السليم. يؤدي استخدام بروتوكول يصل إلى 50 غرامًا من ريتوكسيماب (IgG1 مشتق من خلايا CHO) مع 80 وحدة (10 ميكرولتر) من β1-4 غالاكتوزيداز S (NEB #P0745 في محلول غليكوبفر 1X في حجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر)، وحضانة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، إلى إزالة فعالة لبقايا β1-4 غالاكتوز. مع ذلك، فإن تطبيق ظروف مماثلة على IgG2a الفأري لا يُنتج سوى إزالة بنسبة 70-80% تقريبًا من بقايا β1-4 غالاكتوز. س: ما هي كمية الإكسوغليكوزيداز التي يجب استخدامها؟ ج: تختلف كمية الإنزيم المطلوبة باختلاف الركائز المستخدمة. ابدأ بـ 1-2 ميكرولتر لكل 1 ميكروغرام من البروتين السكري أو 100 نانومول من قليل السكاريد لمدة ساعة واحدة في تفاعل حجمه 10-25 ميكرولتر. إذا كان لا يزال هناك اترك المواد غير المهضومة تتفاعل طوال الليل.