نيو إنجلاند بيولابس، P0746S، غالاكتوزيداز β1-3,4

إنزيم β1-3,4 غالاكتوزيداز هو إنزيم خارجي يحفز تحلل بقايا الغالاكتوز الطرفية غير المختزلة المرتبطة بروابط β1-3 و β1-4 من السكريات قليلة الوحدات. التصنيفات ذات الصلة: الإكسوغليكوزيدازات. التطبيقات: تسلسل الغليكان، التعبير عن البروتينات السكرية المؤتلفة، تحليل البروتينات السكرية. المواصفات: تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لفصل أكثر من 95% من β-D-غالاكتوز الطرفي من 1 نانومول من Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc-7-أمينو-4-ميثيل-كومارين (AMC) في ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول غليكوبافر 4 بتركيز 1X، حضانة عند 37 درجة مئوية. محلول غليكوبافر 4 بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 4.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 20 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار إيدتا، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي النظري: 71 كيلو دالتون. شروط فحص الوحدة : يتم تحضين تخفيفات متسلسلة من β1-3,4 غالاكتوزيداز مع 1 نانومول من الركيزة الموسومة بـ AMC ومحلول غليكوبافر 4 بتركيز 1X في تفاعل حجمه 10 ميكرولتر. يتم تحضين مزيج التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. يتم تصوير فصل نواتج التفاعل باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (1). سؤال وجواب : ما الفرق بين β1-4 جالاكتوزيداز، وβ1-4 جالاكتوزيداز S، وβ1-3,4 جالاكتوزيداز؟ جواب: يُستنسخ β1-4 جالاكتوزيداز (NEB# P0730) من بكتيريا Bacteroides fragilis؛ ويُستنسخ β1-4 جالاكتوزيداز S (NEB# P0745) من بكتيريا Streptococcus pneumoniae؛ ويُستنسخ β1-3,4 جالاكتوزيداز (NEB# P0746) من خصية البقر. يقوم كل من β1-4 جالاكتوزيداز وβ1-4 جالاكتوزيداز S بفصل بقايا الجالاكتوز المرتبطة برابطة β1-4 فقط. بينما يقوم β1-3,4 جالاكتوزيداز (BTG) بفصل بقايا الجالاكتوز المرتبطة بروابط β1-3 وβ1-4. س: هل يستطيع إنزيم β1-3,4 جالاكتوزيداز شطر بقايا الجالاكتوز المرتبطة بروابط β1-6؟ ج: على الرغم من ندرتها في الطبيعة، فقد ثبت أن إنزيم β1-3,4 جالاكتوزيداز يحلل بقايا الجالاكتوز المرتبطة بروابط β1-6 بمعدل أبطأ بكثير من تحلل بقايا الجالاكتوز المرتبطة بروابط β1-3 أو β1-4. س: ما هو عنصر التحكم الإيجابي الجيد لإنزيم β1-3,4 جالاكتوزيداز؟ ج: pNP-βGal (4-نيتروفينيل-β-D-جالاكتوبيرانوزيد). س: هل يمكنني استخدام إنزيم β1-3,4 جالاكتوزيداز في عملية هضم مزدوجة مع إنزيمات إكسوجليكوزيداز و/أو إندوجليكوزيداز أخرى؟ ج: نعم. على الرغم من أن المحلول الأمثل لإنزيم β1-3,4 Galactosidase هو محلول غليكوبفر 4 بتركيز 1X (50 ملي مولار أسيتات الصوديوم، درجة الحموضة 4.5)، فإننا نوصي بهضم إنزيم β1-3,4 Galactosidase مرتين باستخدام إنزيمات إكسوغليكوزيداز أخرى، وذلك باستخدام محلول غليكوبفر 1 بتركيز 1X (50 ملي مولار أسيتات الصوديوم، درجة الحموضة 5.5، 5 ملي مولار كلوريد الكالسيوم). كما نوصي باستخدام محلول غليكوبفر 2 بتركيز 1X (50 ملي مولار فوسفات الصوديوم، درجة الحموضة 7.5) لهضم إنزيم β1-3,4 Galactosidase باستخدام إنزيم PNGase F و/أو إنزيم O-Glycosidase. س: ما هي أفضل طريقة لإعادة تنقية الغليكان أو الغليكوبروتين بعد معالجته بإنزيمات الإكسوغليكوزيداز؟ ج: الترشيح باستخدام مرشحات دقيقة الدوران، أو الاستخلاص الطوري الصلب (على سبيل المثال: خراطيش الكربون المُجرافيت). س: ما هي كمية الإكسوغليكوزيداز اللازمة؟ ج: تختلف كمية الإنزيم المطلوبة باختلاف الركائز المستخدمة. ابدأ بـ 1-2 ميكرولتر لكل 1 ميكروغرام من البروتين السكري أو 100 نانومول من قليل السكاريد لمدة ساعة واحدة في تفاعل حجمه 10-25 ميكرولتر. إذا بقيت مواد غير مهضومة، اترك التفاعل طوال الليل. س: ما هي الجليكوزيدازات وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم الجليكوزيدازات للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات السكرية والببتيدات السكرية. وهي نوعان: الإندوغليكوزيدازات التي تفصل مجموعات الكربوهيدرات بالكامل عن البروتينات، والإكسوغليكوزيدازات التي تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المختزلة للكربوهيدرات. أما النهاية المختزلة فهي تلك التي يُنتجها الإندوغليكوزيداز. يستخدم الباحثون عادةً إنزيمًا داخليًا لتحليل الغليكوزيد، متبوعًا بواحد أو أكثر من الإكسوغليكوزيدازات، ثم يحللون النواتج باستخدام تقنية SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من الاستشراب السائل. س: هل يتطلب هذا الإنزيم ظروفًا مُفسِّخة ليعمل على البروتينات السكرية؟ ج: لا، بشكل عام، تستطيع الإكسوغليكوزيدازات إزالة بقايا السكر من البروتينات السكرية الأصلية (المطوية) (حيث تكون السكريات المحبة للماء بعيدة عن هيكل البروتين). مع ذلك، قد يؤثر طي البروتين حول موقع السكري على إمكانية وصول الإنزيم إليه. يتطلب هضم بعض البروتينات بواسطة الإكسوغليكوزيدازات فترات حضانة أطول، أو في بعض الحالات درجة معتدلة من التفسُّخ. س: هل تُثبِّط المنظفات عمل الغليكوزيدازات؟ ج: عند مستويات معتدلة (0.5-1.0% من المنظفات الأيونية وغير الأيونية)، تُظهر معظم الغليكوزيدازات نشاطًا مُرضيًا أو لا تتأثر. وتشمل الاستثناءات PNGase F و PNGase F Recombinant و Remove-iT PNGase F و O-Glycosidase التي يتم تثبيطها بواسطة SDS.