نيو إنجلاند بيولابس، P0747S، غالاكتوزيداز α1-3,4,6

الفئات ذات الصلة: الإكسوغليكوزيداز، تطبيقات تحليل البروتينات، أنظمة التعبير، تسلسل الغليكان، علم البروتينات، تعريف وحدة المواصفات : تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لفصل أكثر من 95٪ من α-D-غالاكتوز الطرفي من 1 نانومول من Galα1-3Galβ1-4Gal-7-أمينو-4-ميثيل-كومارين (AMC)، في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول غليكوبافر 1 بتركيز 1X، مُضاف إليه 100 ميكروغرام/مل من الألبومين المُعاد تركيبه (منخفض الجلسرين). يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول غليكوبافر 1 بتركيز 1X، 5 ملي مولار من كلوريد الكالسيوم، 50 ملي مولار من أسيتات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 5.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 20 ملي مولار من Tris-HCl، 50 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار من EDTA، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 65 درجة مئوية. الوزن الجزيئي النظري: 39.7 كيلو دالتون. شروط فحص الوحدة: تُحضن تخفيفات متسلسلة من إنزيم غالاكتوزيداز α1-3,4,6 مع 1 نانومول من الركيزة الموسومة بـ AMC في محلول غليكوبافر 1 بتركيز 1X وألبومين بشري مُعاد تركيبه بتركيز 1X في تفاعل حجمه 10 ميكرولتر. يُحضن مزيج التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. يتم تصوير فصل نواتج التفاعل باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (1). الأسئلة الشائعة : س: ما هي الجليكوسيدازات وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم الجليكوسيدازات للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات السكرية والببتيدات السكرية. وهي نوعان: إندوجليكوسيدازات التي تفصل مجموعات الكربوهيدرات بالكامل عن البروتينات، وإكسوجليكوسيدازات التي تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المختزلة للكربوهيدرات. أما النهاية المختزلة فهي تلك التي ينتجها الإندوجليكوسيداز. غالبًا ما يستخدم الباحثون إندوجليكوسيداز متبوعًا بواحد أو أكثر من الإكسوجليكوسيدازات، ثم يحللون النواتج باستخدام SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من الكروماتوغرافيا السائلة. س: ما الفرق بين α1-3,6 جالاكتوزيداز و α1-3,4,6 جالاكتوزيداز؟ ج: إنزيم غالاكتوزيداز α1-3,6 (NEB# P0731) مُستنسخ من بكتيريا Xanthomonas manihotis، وهو مُتخصص في فصل بقايا الغالاكتوز المرتبطة بروابط α1-3 و α1-6 فقط. أما إنزيم غالاكتوزيداز α1-3,4,6 (NEB# P0747) فهو مُستنسخ من حبوب البن الأخضر، وهو إنزيم ذو نطاق أوسع من التخصص، حيث يُحفز تحلل بقايا الغالاكتوز المرتبطة بروابط α1-3 و α1-4 و α1-6. س: هل يُمكنني استخدام إنزيم غالاكتوزيداز α1-3,4,6 في عملية هضم مزدوجة مع إنزيمات إكسوغليكوزيداز و/أو إندوغليكوزيداز أخرى؟ ج: نعم. نوصي بهضم إنزيم غالاكتوزيداز α1-3,4,6 مرتين مع إنزيمات إكسوغليكوزيداز أخرى باستخدام محلول غليكوبفر 1 (50 ملي مولار أسيتات الصوديوم، درجة الحموضة 5.5، 5 ملي مولار كلوريد الكالسيوم). وللحصول على أفضل نشاط لإنزيم غالاكتوزيداز، يُنصح بإضافة rHSA إلى التفاعل. كما نوصي باستخدام محلول غليكوبفر 2 (50 ملي مولار فوسفات الصوديوم، درجة الحموضة 7.5) لهضم إنزيم غالاكتوزيداز α1-3,4,6 مع إنزيم PNGase F و/أو O-غليكوزيداز. س: ما هو عنصر التحكم الإيجابي المناسب لإنزيم غالاكتوزيداز α1-3,4,6؟ ج: بارا-نيتروفينيل α-D-غالاكتوبيرانوزيد (اسم بديل: 4-نيتروفينيل α-D-غالاكتوبيرانوزيد). س: هل يتطلب هذا الإنزيم ظروفًا مُفسِّخة للبروتينات السكرية لكي يعمل عليها؟ ج: لا، بشكل عام، تستطيع الإكسوغليكوزيدازات إزالة بقايا السكر من البروتينات السكرية الأصلية (المطوية) (حيث تتجه السكريات المحبة للماء بعيدًا عن هيكل البروتين). مع ذلك، قد يؤثر طي البروتين حول موقع السكري على إمكانية وصول الإنزيم. يتطلب هضم بعض البروتينات بواسطة الإكسوغليكوزيداز فترات حضانة أطول، أو في بعض الحالات درجة طفيفة من التمسخ. س: ما هي الطريقة المثلى لإعادة تنقية السكريات أو الببتيدات السكرية بعد معالجتها بالإكسوغليكوزيداز؟ ج: الترشيح باستخدام مرشحات دقيقة، أو الاستخلاص الطوري الصلب (على سبيل المثال: خراطيش الكربون الجرافيتي). س: هل تثبط المنظفات عمل الجليكوزيدازات؟ ج: عند مستويات معتدلة (0.5-1.0% من المنظفات الأيونية وغير الأيونية)، تُظهر معظم الجليكوزيدازات نشاطًا مُرضيًا أو لا تتأثر. تشمل الاستثناءات إنزيم PNGase F، وإنزيم PNGase F المؤتلف، وإنزيم Remove-iT PNGase F، وإنزيم O-Glycosidase، حيث يتم تثبيطها بواسطة SDS. س: ما هي كمية الإكسوغليكوزيداز اللازمة؟ ج: تختلف كمية الإنزيم المطلوبة باختلاف الركائز المستخدمة. ابدأ بـ 1-2 ميكرولتر لكل 1 ميكروغرام من البروتين السكري أو 100 نانومول من السكريات قليلة الوحدات لمدة ساعة واحدة في تفاعل حجمه 10-25 ميكرولتر. إذا بقيت مواد غير مهضومة، اترك التفاعل طوال الليل.