نيو إنجلاند بيولابس، P0749S، فوكوسيداز α1-2,4,6 O

إنزيم α1-2,4,6 Fucosidase O هو إنزيم خارجي واسع التخصص يحفز تحلل بقايا الفوكوز المرتبطة بروابط α1-2 و α1-4 و α1-6 الطرفية من السكريات قليلة الوحدات. يتميز هذا الإنزيم بقدرته على فصل بقايا الفوكوز المرتبطة بروابط α1-6 بكفاءة أعلى من الروابط الأخرى. التصنيفات ذات الصلة : الإكسوغليكوزيدازات، تطبيقات تحليل البروتينات: تسلسل الغليكان، علم البروتينات، التعبير عن البروتينات السكرية المؤتلفة. تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لفصل أكثر من 95% من الفوكوز من 1 نانومول من GlcNAc(Fucα1-6)β1-4GlcNAc-AMC خلال ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X، 5 ملي مولار كلوريد الكالسيوم، 50 ملي مولار أسيتات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 5.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 20 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار إيدتا، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 20 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي الظاهري : 49 كيلو دالتون. شروط فحص الوحدة: يتم تحضين تخفيفات متسلسلة من إنزيم فوكوسيداز O α1-2,4,6 مع 1 نانومول من الركيزة الموسومة بـ AMC ومحلول جليكوبازر 1 بتركيز 1X في تفاعل حجمه 10 ميكرولتر. يُحضن مزيج التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. يتم تصوير فصل نواتج التفاعل باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (1). سؤال وجواب : ما الفرق بين إنزيم فوكوسيداز α1-2,3,4,6 وإنزيم فوكوسيداز α1-2,4,6 O؟ جواب: إنزيم فوكوسيداز α1-2,4,6 O، المستنسخ من بكتيريا أومنيتروفيكا، هو إنزيم إكسوغليكوزيداز واسع التخصص، يحفز تحلل بقايا الفوكوز الطرفية α1-6 بكفاءة أعلى من تحلل بقايا الفوكوز المرتبطة بروابط α1-2 و α1-4. إضافةً إلى ذلك، يستطيع إنزيم فوكوسيداز α1-2,4,6 O شطر السكريات المرتبطة بالأمينات المختزلة، وكذلك السكريات التي تحمل علامات فورية. بينما يُستنسخ إنزيم α1-2,3,4,6 Fucosidase (NEB# P0748) من كلية الأبقار ويُعبَّر عنه في بكتيريا الإشريكية القولونية، وهو إنزيم واسع التخصص يحفز تحلل بقايا الفوكوز المرتبطة بروابط α1-2 و α1-6 بكفاءة أعلى من تلك المرتبطة بروابط α1-4 و α1-3. س: هل يستطيع إنزيم α1-2,4,6 Fucosidase O شطر بقايا الفوكوز في وجود جزيئات سكرية موسومة فورياً؟ ج: نعم، يستطيع إنزيم α1-2,4,6 Fucosidase O شطر بقايا الفوكوز من السكريات قليلة الوحدات أو الجزيئات السكرية المُحرَّرة الموسومة بعلامات فورية مثل Instant 2AB أو Instant Procainamide أو RapiFluor. قد تتطلب العينات الموسومة فورياً فترات حضانة أطول (18 ساعة) لإتمام عملية الهضم. س: هل يمكنني استخدام إنزيم α1-2,4,6 Fucosidase O في عملية هضم مزدوجة مع إنزيمات إكسوغليكوزيداز أخرى؟ ج: نعم. نوصي بالهضم المتزامن مع إنزيمات إكسوغليكوزيداز أخرى باستخدام محلول غليكوبفر 1 بتركيز 1X (50 ملي مولار أسيتات الصوديوم، درجة الحموضة 5.5، 5 ملي مولار كلوريد الكالسيوم). على سبيل المثال، يمكن دمج إنزيم α1-2,4,6 Fucosidase O في عملية هضم متزامنة مع إنزيمات إكسوغليكوزيداز أخرى مثل α2-3,6,8,9 Neuraminidase A (NEB# P0722)، وα1-3,4,6 Galactosidase (NEB# P0747)، وβ1-4 Galactosidase S (NEB# P0745)، وβ-N-Acetylglucosaminidase S (NEB# P0744). س: هل يستطيع إنزيم α1-2,4,6 Fucosidase O شطر بقايا الفوكوز α1-3؟ ج: لا، لن يقوم إنزيم α1-2,4,6 Fucosidase O بشطر بقايا الفوكوز α1-3. س: هل يستطيع إنزيم α1-2,4,6 Fucosidase O شطر الركائز المتفرعة والمعقدة؟ ج: يقوم إنزيم α1-2,4,6 Fucosidase O بفصل بقايا الفوكوز المتفرعة من نوع α1-6، وله نشاط ضئيل على بقايا الفوكوز المتفرعة من نوع α1-4. لا يقوم الإنزيم بفصل بقايا الفوكوز المتفرعة من نوع α1-2. قد يلزم فترات حضانة أطول (من 4 ساعات إلى ليلة كاملة) لهضم ركائز السكريات قليلة الوحدات المعقدة ذات التفرعات المتعددة. س: هل يستطيع إنزيم α1-2,4,6 Fucosidase O فصل بقايا الفوكوز من جسم مضاد سليم؟ ج: يكون إنزيم α1-2,4,6 Fucosidase O نشطًا فقط على جسم مضاد سليم إذا تم تقليمه إلى النواة ثلاثية المانوز. س: ما هي درجة حرارة الحضانة المثلى لإنزيم α1-2,4,6 Fucosidase O؟ ج: درجة حرارة الحضانة المثلى عند استخدام الإنزيم وحده هي 50 درجة مئوية. يُحسب تعريف الوحدة الإنزيمية باستخدام درجة حرارة تفاعل 37 درجة مئوية، وذلك لمراعاة عمليات الهضم المتزامنة بواسطة الجليكوزيداز وبروتوكولات تسلسل N-جليكان. تؤدي درجة حرارة التفاعل 37 درجة مئوية إلى انخفاض النشاط بنسبة 35% تقريبًا. س: ما هي أفضل طريقة لإعادة تنقية الجليكان أو الجليكوبروتين بعد المعالجة بالإكسوجليكوزيداز؟ ج: الترشيح باستخدام مرشحات دقيقة الدوران، أو الاستخلاص الطوري الصلب (على سبيل المثال: خراطيش الكربون المُجرافيت).