نيو إنجلاند بيولابس، P0768S، مانوسيداز α1-2,3,6

الفئات ذات الصلة : الإكسوغليكوزيداز، تطبيقات تحليل البروتينات، تسلسل الغليكان، التعبير عن البروتين السكري المؤتلف، مواصفات تحليل البروتين السكري، تعريف الوحدة: تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لفصل أكثر من 95% من المانوز الطرفي من 1 نانومول من Man(α1,3)-Man(β1,4)-GlcNAc-7-amino-4-methyl-coumarin (AMC)، في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول غليكوبافر 4 بتركيز 1X، مضاف إليه زنك بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول غليكوبافر 4 بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 4.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 20 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي النظري : 110 كيلو دالتون . شروط فحص الوحدة: يتم تحضين تخفيفات متسلسلة من إنزيم مانوزيداز α1-2,3,6 مع 1 نانومول من الركيزة الموسومة بـ AMC، ومحلول غليكوبافر 4 بتركيز 1X، وزنك بتركيز 1X في تفاعل حجمه 10 ميكرولتر. يُحضن مزيج التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. يتم تصوير فصل نواتج التفاعل باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (1). الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين إنزيمات مانوسيداز α1-2,3، وα1-6، وα1-2,3,6؟ ج: إنزيم مانوسيداز α1-2,3 (NEB #P0729) وإنزيم مانوسيداز α1-6 (NEB #P0727) مستنسخان من بكتيريا Xanthomonas manihotis، بينما إنزيم مانوسيداز α1-2,3,6 (NEB #P0768) مستنسخ من نبات Canavalia ensiformis (فاصوليا جاك). يقوم إنزيم مانوسيداز α1-2,3 بفصل بقايا المانوز المرتبطة بروابط α1-2 وα1-3 فقط، بينما يقوم إنزيم مانوسيداز α1-6 بفصل بقايا المانوز المرتبطة بروابط α1-6 فقط. بينما يقوم إنزيم مانوسيداز α1-2,3,6 (JBM) بفصل جميع بقايا المانوز المرتبطة بروابط α1-2 و α1-3 و α1-6. س: هل يمكن أن يكون إنزيم مانوسيداز α1-2,3,6 (JBM) نفسه ركيزةً لنشاط المانوسيداز؟ ج: لا. إنزيم مانوسيداز α1-2,3,6 هو بروتين غني بالمانوز ومُغلّف بالجليكوزيل. تتم إزالة معظم الجليكوزيل أثناء التنقية، ولكن تبقى كمية صغيرة من المانوزيل. ويبدو أن جزيئات الجليكان المانوزيلية المتبقية مقاومة للهضم الذاتي. س: ما هو عنصر التحكم الإيجابي الجيد لإنزيم مانوسيداز α1-2,3؟ ج: pNP-α-مانوبيرانوزيد (4-نيتروفينيل α-D-مانوبيرانوزيد) س: عند هضم الركائز المعقدة التي تحتوي على بقايا مانوز α1-6، هل يمكن استخدام إنزيمات مانوز إضافية مع إنزيم مانوسيداز α1-2,3,6؟ ج: نظرًا لأن إنزيم مانوسيداز α1-2,3,6 لديه نشاط أقل قليلاً تجاه بقايا مانوز α1-6 (مقارنةً ببقايا مانوز α1-2 و α1-3)، فقد يكون من المفيد استخدام هذا الإنزيم مع إنزيم مانوسيداز α1-6 (NEB #P0727). يُوصى بالهضم المتسلسل، حيث يتبع الهضم باستخدام إنزيم مانوسيداز α1-2,3,6 المعالجة بإنزيم مانوسيداز α1-6 (NEB #P0727). س: هل يتطلب هذا الإنزيم ظروفًا مُفسِّخة ليعمل على البروتينات السكرية؟ ج: لا، بشكل عام، تستطيع الإكسوغليكوزيدازات إزالة بقايا السكر من البروتينات السكرية الأصلية (المطوية) (حيث تكون السكريات المحبة للماء بعيدة عن هيكل البروتين). مع ذلك، قد يؤثر طي البروتين حول موقع السكري على إمكانية وصول الإنزيم إليه. يتطلب هضم بعض البروتينات بواسطة الإكسوغليكوزيداز فترات حضانة أطول، أو في بعض الحالات درجة طفيفة من التفسُّخ. س: ما هي الطريقة المُثلى لإعادة تنقية السكريات أو الببتيدات السكرية بعد معالجتها بالإكسوغليكوزيداز؟ ج: الترشيح باستخدام مرشحات دقيقة الدوران، أو الاستخلاص الطوري الصلب (على سبيل المثال: خراطيش الكربون المُجرافيت). س: ما هي كمية الإكسوغليكوزيداز المُناسبة؟ ج: تختلف كمية الإنزيم المطلوبة باختلاف الركائز المُستخدمة. ابدأ بـ 1-2 ميكرولتر لكل 1 ميكروغرام من البروتين السكري أو 100 نانومول من السكريات قليلة الوحدات لمدة ساعة واحدة في تفاعل حجمه 10-25 ميكرولتر. إذا بقيت مواد غير مهضومة، اترك التفاعل طوال الليل. س: هل تُثبّط المنظفات إنزيمات الجليكوزيداز؟ ج: عند مستويات معتدلة (0.5-1.0% من المنظفات الأيونية وغير الأيونية)، تُظهر معظم إنزيمات الجليكوزيداز نشاطًا مُرضيًا أو لا تتأثر. تشمل الاستثناءات PNGase F وPNGase F Recombinant وRemove-iT PNGase F وO-Glycosidase التي تُثبّطها SDS. س: ما هي إنزيمات الجليكوزيداز وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم إنزيمات الجليكوزيداز للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات السكرية والببتيدات السكرية. تأتي هذه الإنزيمات بنوعين: إنزيمات التحلل السكري الداخلي التي تفصل مجموعات الكربوهيدرات الكاملة عن البروتينات، وإنزيمات التحلل السكري الخارجي التي تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المختزلة للكربوهيدرات. أما النهاية المختزلة فهي تلك التي ينتجها إنزيم التحلل السكري الداخلي. يستخدم الباحثون عادةً إنزيم التحلل السكري الداخلي متبوعًا بواحد أو أكثر من إنزيمات التحلل السكري الخارجي، ثم يحللون النواتج باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من الاستشراب السائل.