نيو إنجلاند بيولابس، P0769S، فوكوسيداز α1-3,4

الفئات ذات الصلة : الإكسوغليكوزيداز، تطبيقات تحليل البروتينات، أنظمة التعبير، تسلسل الغليكان، علم البروتينات، تعريف وحدة المواصفات : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لفصل أكثر من 95% من ألفا-فوكوز من 1 نانومول من Galβ1-4GlcNAcβ1-3(Fucα1-3)Galβ1-4Glc-7-أمينو-4-ميثيل-كومارين (AMC)، في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. شروط التفاعل: 1X GlycoBuffer 1، مكمل بـ 100 ميكروغرام/مل من الألبومين المؤتلف (منخفض الجلسرين)، حضانة عند 37 درجة مئوية، 1X GlycoBuffer 1، 5 ملي مولار CaCl2، 50 ملي مولار أسيتات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 5.5 عند 25 درجة مئوية)، محلول التخزين 20 mM Tris-HCl 50 mM NaCl 1 mM EDTA pH 7.5 @ 25°C تعطيل حراري 65°C لمدة 10 دقائق الوزن الجزيئي الظاهري : 56 كيلو دالتون شروط اختبار الوحدة : يتم تحضين تخفيفات متسلسلة من إنزيم ألفا-1-3،4 فوكوسيداز مع 1 نانومول من الركيزة الموسومة بـ AMC في محلول جليكوبفر 1 بتركيز 1X مضاف إليه rHSA بتركيز 1X في تفاعل حجمه 10 ميكرولتر. يتم تحضين مزيج التفاعل عند 37°C لمدة ساعة واحدة. يتم تصوير فصل نواتج التفاعل باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (1). الأسئلة الشائعة: س: ما الفرق بين إنزيم ألفا-1-2 فوكوسيداز، وإنزيم ألفا-1-3،4،6 فوكوسيداز، وإنزيم ألفا-1-3،4 فوكوسيداز؟ أ: تم استنساخ إنزيم α1-2 Fucosidase (NEB# P0724) من بكتيريا Xanthomonas manihotis، وهو متخصص في فصل بقايا الفوكوز الخطية المرتبطة بروابط α1-2. أما إنزيم α1-2,4,6 Fucosidase (NEB# P0748) فقد تم استنساخه من كلية الأبقار، ويتم التعبير عنه في بكتيريا E. coli، وهو إنزيم واسع التخصص يحفز تحلل بقايا الفوكوز المرتبطة بروابط α1-2 و α1-4 و α1-6. في حين تم استنساخ إنزيم α1-3,4 Fucosidase (NEB# P0769) من شجرة اللوز الحلو (Prunus dulcis)، ويتم التعبير عنه في خميرة Pichia pastoris. إنزيم α1-3,4 فوكوسيداز هو إنزيم واسع التخصص يحفز تحلل بقايا الفوكوز المرتبطة بروابط α1-3 و α1-4 في السكريات قليلة الوحدات والبروتينات السكرية. س: هل يمكنني استخدام إنزيم α1-3,4 فوكوسيداز في عملية هضم مزدوجة مع إنزيمات إكسوغليكوزيداز و/أو إندوغليكوزيداز أخرى؟ ج: نعم. نوصي بإجراء عملية هضم مزدوجة لإنزيم α1-3,4 فوكوسيداز مع إنزيمات إكسوغليكوزيداز أخرى باستخدام محلول غليكوبفر 1 بتركيز 1X (50 ملي مولار أسيتات الصوديوم، درجة الحموضة 5.5، 5 ملي مولار كلوريد الكالسيوم). وللحصول على أفضل نشاط لإنزيم الفوكوسيداز، يُنصح بإضافة الألبومين البشري المؤتلف (rHSA) إلى التفاعل. نوصي باستخدام محلول غليكوبافر 2 بتركيز 1X (50 ملي مولار فوسفات الصوديوم، درجة الحموضة 7.5) لهضم إنزيم α1-3,4 فوكوسيداز باستخدام إنزيم PNGase F و/أو إنزيم O-غليكوسيداز. س: هل يستطيع إنزيم α1-3,4 فوكوسيداز شطر بقايا الفوكوز α1-3 الأساسية؟ ج: لا، إنزيم α1-3,4 فوكوسيداز غير قادر على إزالة بقايا الفوكوز α1-3 الأساسية. مع ذلك، يستطيع شطر بقايا الفوكوز α1-3 الموجودة على الذراع الخارجي للسكريات المرتبطة بالنيتروجين. س: هل يستطيع إنزيم α1-3,4 فوكوسيداز وإنزيم α1-2,3,4,6 فوكوسيداز شطر الركائز المتفرعة والمعقدة؟ ج: يمكن لإنزيمي α1-3,4 Fucosidase و α1-2,3,4,6 Fucosidase شطر الركائز المتفرعة البسيطة بالكامل في غضون ساعة واحدة. مع ذلك، قد يتطلب الهضم الكامل للركائز المعقدة ذات التفرعات المتعددة تركيزًا أعلى من الإنزيم وفترة حضانة أطول (من 4 ساعات إلى ليلة كاملة). س: ما هي الجليكوسيدازات وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم الجليكوسيدازات للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات السكرية والببتيدات السكرية. وهي نوعان: إندوجليكوسيدازات تفصل مجموعات الكربوهيدرات بالكامل من البروتينات، وإكسوجليكوسيدازات تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المختزلة للكربوهيدرات. أما النهاية المختزلة فهي تلك التي يُنتجها إندوجليكوسيداز. غالبًا ما يستخدم الباحثون إندوجليكوسيداز متبوعًا بواحد أو أكثر من الإكسوجليكوسيدازات، ثم يحللون النواتج باستخدام SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من الكروماتوغرافيا السائلة. س: هل تُثبّط المنظفات عمل الجليكوسيداز؟ ج: عند مستويات معتدلة (0.5-1.0% من المنظفات الأيونية وغير الأيونية)، تُظهر معظم الجليكوسيداز نشاطًا مُرضيًا أو لا تتأثر. تشمل الاستثناءات PNGase F وPNGase F المُعاد تركيبه وRemove-iT PNGase F وO-Glycosidase التي تُثبّطها SDS. س: ما هي الطريقة المُثلى لإعادة تنقية الجليكان أو الجليكوبروتين بعد المعالجة بالإكسوجليكوسيداز؟ ج: الترشيح باستخدام مرشحات الغزل الدقيقة، أو الاستخلاص الطوري الصلب (على سبيل المثال: خراطيش الكربون المُجرافيت). س: هل يتطلب هذا الإنزيم ظروفًا مُغيّرة للبروتين ليعمل على الجليكوبروتينات؟ ج: لا، بشكل عام، تستطيع الإكسوجليكوسيداز إزالة بقايا السكر من الجليكوبروتينات الأصلية (المطوية) (حيث تتجه السكريات المحبة للماء بعيدًا عن العمود الفقري للبروتين). مع ذلك، قد يؤثر طي البروتين حول موقع الغليكان على سهولة وصول الإنزيم. يتطلب هضم بعض البروتينات بواسطة الإكسوغليكوزيداز فترات حضانة أطول، أو في بعض الحالات درجة طفيفة من التمسخ. س: ما هي كمية الإكسوغليكوزيداز اللازمة؟ ج: تختلف كمية الإنزيم المطلوبة باختلاف الركائز المستخدمة. ابدأ بـ 1-2 ميكرولتر لكل 1 ميكروغرام من البروتين السكري أو 100 نانومول من قليل السكاريد لمدة ساعة واحدة في تفاعل حجمه 10-25 ميكرولتر. إذا بقيت مواد غير مهضومة، اترك التفاعل طوال الليل.