مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، P0771S، Endo F3

إنزيم Endo F3 هو إنزيم داخلي لتحليل السكريات، يقوم بفصل السكريات قليلة الوحدات المعقدة ثنائية وثلاثية التفرع المرتبطة بالنيتروجين والمُفَكوزة من البروتينات السكرية، وذلك من داخل لب الكيتوبيوز. يُوسَم إنزيم Endo F3 بنطاق ربط الكيتين (CBD) لتسهيل إزالته. التصنيفات ذات الصلة : إنزيمات تحليل السكريات الداخلية، تطبيقات تحليل البروتينات، أنظمة التعبير، تسلسل السكريات، علم البروتينات، تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لفصل أكثر من 95% من الكربوهيدرات من 10 ميكروغرام من الفيبرينوجين الخنزيري خلال ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول جليكوبازر 4 بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. جليكوبازر 4: 50 ملي مولار أسيتات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 4.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 20 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 5 ملي مولار إيدتا، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي الظاهري : 38.8 كيلو دالتون. شروط فحص الوحدة : يتم تحضين تخفيفات متسلسلة من إنزيم إندو إف 3 مع 10 ميكروغرام من الفيبرينوجين الخنزيري ومحلول جليكوبازر 4 بتركيز 1X في تفاعل حجمه 10 ميكرولتر. يُحضن مزيج التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. يتم تصوير فصل نواتج التفاعل باستخدام تقنية SDS-PAGE. الأسئلة الشائعة : س: هل إنزيم إندو إف 3 موسوم؟ ج: إنزيم إندو إف 3 موسوم بنطاق ربط الكيتين (CBD). تسمح علامة CBD بإزالتها من التفاعل باستخدام خرز الكيتين (NEB #S6651) أو خرز الكيتين المغناطيسي (NEB #E8036). ملاحظة: لا يوجد موقع انقسام بين إنزيم Endo F3 وعلامة CBD لتمكين إزالة هذه العلامة من إنزيم Endo F3. س: ما الفرق بين إنزيم PNGase F وإنزيم Endo F3؟ ج: يقوم إنزيم PNGase F بالانقسام بين بقايا GlcNAc والأسباراجين الداخلية في السكريات قليلة الوحدات عالية المانوز، والهجينة، والمعقدة من البروتينات السكرية المرتبطة بالنيتروجين. بينما يتميز إنزيم Endo F3 بخصوصية عالية لإزالة السكريات المرتبطة بالنيتروجين داخل لب الكيتوبيوز في البروتينات السكرية التي تحتوي على سكريات قليلة الوحدات ثنائية وثلاثية التفرع مُفَكوزة. س: ما هي كمية إنزيم Endo F3 التي يجب استخدامها لإزالة السكريات من البروتين السكري في الظروف الطبيعية؟ ج: يجب دائمًا استخدام إنزيم Endo F3 في الظروف الطبيعية. نوصي باستخدام 1 ميكرولتر من إنزيم Endo F3 لكل 20 ميكروغرام من البروتين السكري الطبيعي. يجب تحديد أوقات الحضانة المثلى وتركيزات الإنزيم تجريبيًا لكل ركيزة. ظروف التفاعل النموذجية هي كما يلي: امزج 20 ميكروغرام من البروتين السكري، و1 ميكرولتر من محلول Glycobuffer 4 بتركيز 10X، والماء (إذا لزم الأمر) للحصول على حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. أضف 1 ميكرولتر من إنزيم Endo F3. حضّن التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. س: ما هي الركيزة المفضلة لإنزيم Endo F3؟ ج: الفيبرينوجين الخنزيري هو بروتين سكري يحتوي على غليكانات N-مرتبطة ثنائية التفرع ومُفَكوزة، ويمكن استخدامه كعنصر تحكم إيجابي لإنزيم Endo F3. س: هل تُثبّط المنظفات نشاط إنزيم Endo F3؟ ج: يجب استخدام إنزيم Endo F3 فقط في ظروف غير مُفسِّخة (طبيعية). تُثبّط المنظفات، مثل SDS، نشاط إنزيم Endo F3. س: ما هو الرقم الهيدروجيني الأمثل لنشاط إنزيم Endo F3؟ ج: الرقم الهيدروجيني الأمثل لكسر السكريات ثنائية التفرع المُفَكوزة (مثل الفيبرينوجين الخنزيري) وثلاثية التفرع (مثل الفيوتين) بواسطة إنزيم Endo F3 هو 4.5 (محلول غليكوبافر 4 بتركيز 10X). مع ذلك، يمكن أيضًا كسر السكريات ثنائية التفرع المُفَكوزة بواسطة إنزيم Endo F3 عند الرقم الهيدروجيني 6.0 (محلول غليكوبافر 3 بتركيز 10X). س: كيف يُمكنني إزالة إنزيم Endo F3 من التفاعل؟ ج: يُمكن إزالة إنزيم Endo F3 من تفاعل إزالة السكريات باستخدام خرزات الكيتين المغناطيسية من شركة NEB. فيما يلي ظروف التفاعل النموذجية باستخدام خرز الكيتين المغناطيسي: المواد: إندو F3 (NEB #P0771)، خرز الكيتين المغناطيسي (NEB #E8036)، حامل الفصل المغناطيسي (NEB #S1506، NEB #S1509). ضع 50 ميكرولتر من خرز الكيتين المغناطيسي (NEB #E8036) في أنبوب إيبندورف، ثم ضع الأنبوب في حامل الفصل المغناطيسي (NEB #S1506 أو #S1509S). دع المغناطيس يجذب خرز الكيتين، ثم اسحب السائل الطافي وتخلص منه. مع بقاء أنبوب الإيبندورف على حامل الفصل المغناطيسي، اغسل خرز الكيتين المغناطيسي 3 مرات (500 ميكرولتر في كل مرة) بمحلول فورمات الأمونيوم 50 ملي مولار عند درجة حموضة 4.4 (أو محلول منظم من اختيارك). اسحب السائل الطافي وتخلص منه. أضف عينة البروتين السكري منزوع الغليكوزيل إلى أنبوب الإيبندورف مع خرز الكيتين المغناطيسي. رج الأنبوب برفق. ضع عينة البروتين السكري مع خرز الكيتين المغناطيسي لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 مئوية. أعد وضع أنبوب إيبندورف على حامل الفصل المغناطيسي، واترك المغناطيس يجذب خرز الكيتين. اسحب السائل الطافي باستخدام ماصة واحتفظ به. اغسل خرز الكيتين المغناطيسي 3 مرات (100 ميكرولتر في كل مرة) بمحلول فورمات الأمونيوم 50 ملي مولار عند درجة حموضة 4.4 (أو محلول منظم من اختيارك). اسحب السائل الطافي من كل غسلة واحتفظ به. اجمع جميع السوائل الطافية من الخطوتين 5 و6، لأنها تمثل البروتين السكري منزوع الغليكوزيل. حلل العينة بالطريقة التي تختارها. ملاحظة: يمكن زيادة إزالة إنزيم Endo F3 من تفاعل إزالة الغليكوزيل خطيًا بزيادة حجم خرز الكيتين المغناطيسي. س: ما هي قدرة ارتباط خرز الكيتين المغناطيسي المستخدم لإزالة إنزيم Endo F3؟ ج: قدرة ارتباط خرز الكيتين المغناطيسي (NEB #E8036) هي 0.4 ميكروغرام/ميكرولتر من البروتين الموسوم بـ CBD. س: هل إنزيم Endo F3 متوافق مع التحليلات اللاحقة مثل كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC) وقياس الطيف الكتلي؟ ج: إنزيم Endo F3 ومحلول 10X Glycobuffer 4 متوافقان مع قياس الطيف الكتلي وكروماتوغرافيا السائل عالي الأداء. س: ما هي الجليكوسيدازات وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم الجليكوسيدازات للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات السكرية والببتيدات السكرية. وهي نوعان: إندوجليكوسيدازات التي تفصل مجموعات الكربوهيدرات بالكامل عن البروتينات، وإكسوجليكوسيدازات التي تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المختزلة للكربوهيدرات. أما النهاية المختزلة فهي تلك التي ينتجها إنزيم إندوجليكوسيداز. غالبًا ما يستخدم الباحثون إنزيم إندوجليكوسيداز متبوعًا بواحد أو أكثر من الإكسوجليكوسيدازات، ثم يحللون النواتج باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من كروماتوغرافيا السائل.