مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، P0772S، Endo F2

الفئات ذات الصلة تطبيقات الإندوغليكوزيداز تسلسل الغليكان تعريف الوحدة يتم تعريف الوحدة الواحدة على أنها كمية الإنزيم المطلوبة لفصل أكثر من 95٪ من الكربوهيدرات من 10 ميكروغرام من الفيبرينوجين الخنزيري في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول جليكوبازر 4 بتركيز 1X، حضانة عند 37 درجة مئوية. محلول جليكوبازر 4 بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 4.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 20 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 5 ملي مولار إيدتا، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي الظاهري : 39.8 كيلو دالتون. شروط فحص الوحدة: يتم تحضين تخفيفات متسلسلة من إنزيم إندو إف 2 مع 10 ميكروغرام من الفيبرينوجين الخنزيري ومحلول جليكوبازر 4 بتركيز 1X في تفاعل حجمه 10 ميكرولتر. يتم تحضين مزيج التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. يتم تصوير فصل نواتج التفاعل باستخدام تقنية SDS-PAGE. الأسئلة الشائعة : س: هل إنزيم إندو إف 2 موسوم؟ ج: إنزيم إندو إف 2 موسوم بنطاق ربط الكيتين (CBD). تسمح علامة CBD بإزالتها من التفاعل باستخدام خرز الكيتين (NEB #S6651) أو خرز الكيتين المغناطيسي (NEB #E8036). ملاحظة: لا يوجد موقع انقسام بين إنزيم Endo F2 وعلامة CBD لتمكين إزالة هذه العلامة من إنزيم Endo F2. س: ما الفرق بين إنزيم PNGase F وإنزيم Endo F2؟ ج: يقوم إنزيم PNGase F بالانقسام بين بقايا GlcNAc والأسباراجين الداخلية في السكريات قليلة الوحدات عالية المانوز، والهجينة، والمعقدة من البروتينات السكرية المرتبطة بالنيتروجين. بينما يتميز إنزيم Endo F2 بخصوصية عالية لإزالة السكريات المرتبطة بالنيتروجين داخل لب الكيتوبيوز في البروتينات السكرية التي تحتوي فقط على سكريات قليلة الوحدات ثنائية التفرع (وبمعدل أقل) عالية المانوز. س: ما الفرق بين إنزيم Endo F2 وإنزيم Endo F3؟ ج: يزيل إنزيم Endo F2 السكريات المرتبطة بالنيتروجين داخل لب الكيتوبيوز في البروتينات السكرية التي تحتوي فقط على سكريات قليلة التفرع ثنائية التفرع، وبمعدل أقل، سكريات قليلة المانوز عالية التركيز. بينما يتميز إنزيم Endo F3 بانتقائية عالية لإزالة السكريات المرتبطة بالنيتروجين داخل لب الكيتوبيوز في البروتينات السكرية التي تحتوي على سكريات قليلة التفرع ثنائية وثلاثية التفرع مُفَكوزة. س: ما هي كمية إنزيم Endo F2 التي يجب استخدامها لإزالة السكريات من البروتين السكري في الظروف الطبيعية؟ ج: نوصي باستخدام 1 ميكرولتر من إنزيم Endo F2 لكل 20 ميكروغرام من البروتين السكري الطبيعي. يجب تحديد أوقات الحضانة المثلى وتركيزات الإنزيم تجريبيًا لكل ركيزة على حدة. ظروف التفاعل النموذجية هي كما يلي: امزج 20 ميكروغرامًا من البروتين السكري، و1 ميكرولتر من محلول غليكوبفر 4 بتركيز 10X، والماء (إذا لزم الأمر) لتكوين حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. أضف 1 ميكرولتر من إنزيم إندو F2. حضّن التفاعل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. س: ما هو الركيزة المفضلة لإنزيم إندو F2؟ ج: الفيبرينوجين الخنزيري هو بروتين سكري يحتوي على غليكانات ثنائية التفرع مرتبطة بالنيتروجين ومُفَكوزة، ويمكن استخدامه كعنصر تحكم إيجابي لإنزيم إندو F2. س: هل تُثبّط المنظفات نشاط إنزيم إندو F2؟ ج: يُستخدم إنزيم إندو F2 عادةً في ظروف غير مُفسِّخة (طبيعية)، حيث أن التفسُّخ ليس ضروريًا للنشاط الأمثل للإنزيم. ومع ذلك، فإن إنزيم إندو F2 يكون نشطًا في ظروف التفسُّخ. لا تُثبّط تركيزات 0.5% من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) نشاط إنزيم إندو F2 عند استخدامها بوجود 1% من NP-40. س: ما هو الرقم الهيدروجيني الأمثل لنشاط إنزيم إندو F2؟ ج: الرقم الهيدروجيني الأمثل لكسر السكريات ثنائية التفرع بواسطة إنزيم إندو F2 هو 4.5 (محلول جليكوبفر 4 بتركيز 10 أضعاف). س: كيف يُمكنني إزالة إنزيم إندو F2 من التفاعل؟ ج: يُمكن إزالة إنزيم إندو F2 من تفاعل إزالة السكريات باستخدام خرزات الكيتين المغناطيسية من شركة NEB. فيما يلي ظروف التفاعل النموذجية باستخدام خرز الكيتين المغناطيسي: المواد: إندو F2 (NEB# P0772)، خرز الكيتين المغناطيسي (NEB# E8036)، حامل الفصل المغناطيسي (NEB# S1506، NEB# S1509). ضع 50 ميكرولتر من خرز الكيتين المغناطيسي (NEB# E8036) في أنبوب إيبندورف، ثم ضع الأنبوب في حامل الفصل المغناطيسي (NEB# S1506، NEB# S1509). دع المغناطيس يجذب خرز الكيتين، ثم اسحب السائل الطافي وتخلص منه. مع بقاء أنبوب الإيبندورف على حامل الفصل المغناطيسي، اغسل خرز الكيتين المغناطيسي ثلاث مرات (500 ميكرولتر في كل مرة) بمحلول فورمات الأمونيوم 50 ملي مولار، درجة الحموضة 4.4 (أو محلول منظم من اختيارك). اسحب السائل الطافي وتخلص منه. أضف عينة البروتين السكري منزوع الغليكوزيل إلى أنبوب الإيبندورف الذي يحتوي على خرز الكيتين المغناطيسي. قم بتحريك عينة البروتين السكري منزوع الغليكوزيل مع خرز الكيتين المغناطيسي لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 مئوية. أعد وضع أنبوب إيبندورف على حامل الفصل المغناطيسي، واترك المغناطيس يجذب خرز الكيتين. اسحب السائل الطافي باستخدام ماصة واحتفظ به. اغسل خرز الكيتين المغناطيسي 3 مرات (100 ميكرولتر في كل مرة) بمحلول فورمات الأمونيوم 50 ملي مولار عند درجة حموضة 4.4 (أو محلول منظم من اختيارك). اسحب السائل الطافي من كل غسلة واحتفظ به. اجمع جميع السوائل الطافية من الخطوتين 5 و6، لأنها تمثل البروتين السكري منزوع الغليكوزيل. حلل العينة بالطريقة التي تختارها. ملاحظة: يمكن زيادة إزالة إنزيم Endo F2 من تفاعل إزالة الغليكوزيل خطيًا بزيادة حجم خرز الكيتين المغناطيسي. سؤال: ما هي قدرة خرز الكيتين المغناطيسي المستخدمة لإزالة إنزيم Endo F2 على الارتباط؟ ج: تبلغ قدرة ربط خرز الكيتين المغناطيسي (NEB# E8036) 0.4 ميكروغرام/ميكرولتر من البروتين الموسوم بـ CBD. س: هل إنزيم Endo F2 متوافق مع التحليلات اللاحقة مثل HPLC وقياس الطيف الكتلي؟ ج: إنزيم Endo F2 ومحلول 10X Glycobuffer 4 متوافقان مع كل من قياس الطيف الكتلي وHPLC. س: ما هي الجليكوسيدازات وما استخداماتها؟ ج: تُستخدم الجليكوسيدازات للحصول على معلومات حول مجموعات الكربوهيدرات المرتبطة بالبروتينات السكرية والببتيدات السكرية. وهي نوعان: إندوجليكوسيدازات التي تفصل مجموعات الكربوهيدرات بالكامل عن البروتينات، وإكسوجليكوسيدازات التي تزيل السكريات الأحادية من النهايات غير المختزلة للكربوهيدرات. أما النهاية المختزلة فهي تلك التي يُنتجها إنزيم إندوجليكوسيداز. يستخدم الباحثون في كثير من الأحيان إنزيم إندوغليكوزيداز متبوعًا بواحد أو أكثر من إنزيمات إكسوغليكوزيداز، ثم يقومون بتحليل المنتجات باستخدام SDS-PAGE أو أنواع مختلفة من الكروماتوغرافيا السائلة.