نيو إنجلاند بيولابس، P0777S، إندو-بيتا-جالاكتوزيداز

الفئات ذات الصلة تطبيقات الإندوغليكوزيداز تحليل البروتين السكري المواصفات الوحدة التعريف يتم تحديد نشاط الإنزيم من خلال قدرته على شطر أكثر من 95٪ من 2 نانومول من Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc-7-amino-4-methyl-coumarin (AMC) باستخدام أقل من 10 نانوغرام من الإنزيم في غضون ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية، في حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول جليكوبازر 3 بتركيز 1X، حضانة عند 37 درجة مئوية. محلول جليكوبازر 3 بتركيز 1X، أسيتات الصوديوم 50 ملي مولار (الأس الهيدروجيني 6 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: أسيتات الصوديوم 50 ملي مولار، كلوريد الصوديوم 50 ملي مولار، الأس الهيدروجيني 5.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي الظاهري : 40.8 كيلو دالتون. شروط فحص الوحدة : يتم تحضين تخفيفات متسلسلة من إنزيم إندو-بيتا-جالاكتوزيداز مع 2 نانومول من الركيزة الموسومة بـ AMC في محلول جليكوبازر 3 بتركيز 1X في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر. يتم تحضين مزيج التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. يتم تصوير فصل نواتج التفاعل باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة. سؤال وجواب : هل تثبط المنظفات إنزيم إندو-بيتا-جالاكتوزيداز (NEB #P0777)؟ ج: يمكن تثبيط نشاط إنزيم إندو-بيتا-جالاكتوزيداز بواسطة المنظفات الأيونية، مثل SDS، بتراكيز معتدلة (0.5-1%). ولمواجهة هذا التثبيط، من الضروري إضافة NP-40 بتركيز نهائي 1% إلى مزيج التفاعل. في المقابل، يمكن للمنظفات غير الأيونية، مثل Tween 20 وTriton X-100 وNP-40، أن تُثبّت إنزيم إندو-بيتا-جالاكتوزيداز وتُعزز نشاطه النوعي. س: ما هي كمية إنزيم إندو-بيتا-جالاكتوزيداز (NEB #P0777) اللازمة للتفاعل؟ ج: تعتمد الكمية المطلوبة من إنزيم إندو-بيتا-جالاكتوزيداز على الركيزة النوعية. كدليل إرشادي مبدئي، استخدم 1-2 ميكرولتر من الإنزيم لكل 10-20 ميكروغرام من البروتين السكري في تفاعل حجمه 10 ميكرولتر لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. في دراساتنا، باستخدام بروتين مرتبط بالسكر، لاحظنا أن الإنزيم يعمل بكفاءة ضمن نطاق واسع من النسب المولية بين البروتين والإنزيم، من 2:1 إلى 150:1، وهو ما يُترجم إلى نسبة تتراوح بين 50 و3500 ضعف تقريبًا بين جزيء السكر والإنزيم في ظل الظروف المثلى. نوصي بالبدء بنسبة تتراوح بين 10:1 و20:1 وإجراء تجربة معايرة لتحسين الظروف بما يتناسب مع الركيزة الخاصة بك. س: هل يُمكنني استخدام محلول منظم مختلف عن محلول GlycoBuffer 3 المُرفق مع إنزيم Endo-β-Galactosidase (NEB #P0777)؟ ج: نعم، يُمكنك استخدام محلول منظم مختلف، حيث أن إنزيم Endo-β-Galactosidase (EBG) الخاص بنا نشط ضمن نطاق واسع من الرقم الهيدروجيني (من 3.5 إلى 9). مع ذلك، يحدث التحلل الأمثل عند الرقم الهيدروجيني 6.0 تقريبًا. عند درجة حموضة 8.0، ينخفض ​​النشاط إلى أقل من 50%، وينخفض ​​أكثر عند درجة حموضة 8.5 بعد ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في اختبارنا القياسي. لتحسين التحلل في ظروف حموضة غير مثالية، قم بتمديد فترة الحضانة، أو زيادة كمية الإنزيم، أو كليهما. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤثر تركيب المحلول المنظم وتركيز الملح على الكفاءة. على سبيل المثال، في تجاربنا، كان أداء محلول فوسفات الصوديوم بتركيز 50 ملي مولار (درجة حموضة 7.4) أفضل من محلول الفوسفات الملحي (PBS) بتركيز 1x عند نفس درجة الحموضة. س: ماذا لو كان الهضم غير مكتمل عند استخدام إنزيم إندو-بيتا-جالاكتوزيداز (NEB #P0777)؟ ج: تعتمد كمية الإنزيم المطلوبة للهضم الكامل على بنية الركيزة ونقائها وكميتها. يمكن أن تقلل التعديلات مثل التفرع أو إضافة الفوكوز من التحلل الإنزيمي أو تمنعه، وقد تتحلل السكريات قليلة الوحدات في مجموعة النيولاكتو بمعدلات منخفضة بشكل ملحوظ. لمعالجة الهضم غير الكامل، يمكنك إطالة فترة الحضانة، أو زيادة تركيز الإنزيم، أو الجمع بينهما. مع ذلك، من غير المرجح أن تؤدي الحضانة لأكثر من 8 ساعات عند 37 درجة مئوية إلى تحسن ملحوظ. س: ما الفرق بين إندو-بيتا-جالاكتوزيداز، وبيتا1-4 جالاكتوزيداز، وبيتا1-4 جالاكتوزيداز إس، وبيتا1-3،4 جالاكتوزيداز؟ ج: إندو-بيتا-جالاكتوزيداز (NEB #P0777S) هو إندوجليكوزيداز، بينما بيتا1-4 جالاكتوزيداز (NEB #P0730S)، وبيتا1-4 جالاكتوزيداز إس (NEB #P0745S)، وبيتا1-3،4 جالاكتوزيداز (NEB #P0746S) هي إكسوجليكوزيدازات. تُستخلص هذه الإنزيمات من كائنات حية مختلفة وتستهدف ركائز مختلفة. تم استنساخ إنزيم إندو-بيتا-جالاكتوزيداز من بكتيريا Flavobacterium keratolyticus، وإنزيم بيتا-1-4 جالاكتوزيداز من بكتيريا Bacteroides fragilis، وإنزيم بيتا-1-4 جالاكتوزيداز S من بكتيريا Streptococcus pneumoniae، وإنزيم بيتا-1-3،4 جالاكتوزيداز (BTG) من خصية البقر. يقوم إنزيم إندو-بيتا-جالاكتوزيداز بفصل روابط بيتا-1-4-جالاكتوز الداخلية ضمن تراكيب بولي-N-أسيتيل لاكتوزامين [Galβ(1-4)-↓-GlcNAcβ(1-3)]. في المقابل، يقوم كل من β1-4 Galactosidase و β1-4 Galactosidase S بفصل بقايا الجالاكتوز الخارجية عبر روابط β(1-4)، بينما يقوم β1-3,4 Galactosidase (BTG) بفصل بقايا الجالاكتوز الخارجية المرتبطة عبر روابط β(1-3) و β(1-4).