مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، P6042S، فيتوين

الفيوتين هو بروتين سكري يحتوي على سلاسل سكرية مرتبطة بروابط N و O، ويمكن استخدامه كعنصر تحكم إيجابي لإنزيمات الإندوغليكوزيداز التي تقطع الكربوهيدرات المرتبطة بروابط N و O. التصنيفات ذات الصلة: ركائز البروتينات السكرية، التطبيقات : أنظمة التعبير، تسلسل الغليكان، التعبير عن البروتينات السكرية المؤتلفة، المواصفات: محلول التخزين : ماء Milli-Q بتركيز 1X، الوزن الجزيئي الظاهري : 48.4 كيلو دالتون. الأسئلة الشائعة : س: ما هي ركيزة التحكم الجيدة للإندوغليكوزيداز؟ ج: بالنسبة لإنزيم O-غليكوزيداز (NEB# P0733) ومزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين (NEB# P6039S)، نقترح استخدام الفيوتين (NEB# P6042). بالنسبة لإنزيم PNGase F (NEB # P0704، P0705، P0706)، نقترح استخدام إنزيم RNase B (NEB# P7817S) أو بروتين فيتوين (NEB# P6042). س: لماذا يُعدّ بروتين فيتوين ركيزة تحكم جيدة لكل من إنزيم O-جليكوزيداز، وإنزيم PNGase F، ومزيج إزالة الجليكوزيل من البروتين؟ ج: بروتين فيتوين هو بروتين سكري يحتوي على كلٍ من السكريات المرتبطة بالنيتروجين (N-linked) والسكريات المرتبطة بالأكسجين (O-linked)، ويمكن تحليله باستخدام تحليل إزاحة الجل SDS-PAGE، أو مطياف الكتلة، أو طرق أخرى متنوعة. س: ما هي ظروف تفاعل إزالة الجليكوزيل من بروتين فيتوين النموذجية؟ ج: امزج 2 ميكرولتر من بروتين فيتوين، و1 ميكرولتر من محلول إزالة طبيعة البروتين السكري بتركيز 10X، و5 ميكرولتر من الماء. حضّن المزيج عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أضف 1 ميكرولتر من محلول غليكوبفر 2 بتركيز 10X و1 ميكرولتر من محلول NP-40 بتركيز 10%. أضف 1 ميكرولتر من الإندوغليكوزيداز. حضّن المزيج عند درجة حرارة 37 مئوية لمدة ساعة. راقب نواتج التفاعل على هلام SDS-PAGE بتركيز 10-20%. س: هل تُثبّط المنظفات الإكسوغليكوزيداز/الإندوغليكوزيداز؟ ج: عند مستويات معتدلة (0.5-1.0% من المنظفات الأيونية وغير الأيونية)، تُظهر معظم الغليكوزيدازات نشاطًا مُرضيًا أو لا تتأثر. الاستثناءات هي: PNGase F (جميع التركيبات)، وO-غليكوزيداز، وβ-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز، والتي يُثبّطها SDS. من الضروري إضافة NP-40 بتركيز نهائي 1% إلى مزيج التفاعل لمواجهة تثبيط المنظفات. يُثبَّط إنزيم Endo D أيضًا بواسطة SDS، إلا أن NP-40 لا يُعاكس هذا التثبيط. أخيرًا، قد تمنع عوامل التثبيت الشائعة مثل Tween وTriton X-100 وNP-40 وoctyl glucoside وsulfobetaines غير المُنظِّفة، بالإضافة إلى آثار المذيبات العضوية، عملية إزالة الغليكوزيل السريعة المثلى بواسطة Rapid PNGase F. س: ما كمية الإندوغليكوزيداز التي يجب استخدامها لإزالة الغليكوزيل من Fetuin في الظروف الطبيعية؟ ج: عندما لا يكون Fetuin مُشوَّهًا، قد يواجه الإندوغليكوزيداز صعوبة أكبر في الوصول إلى موقع انقسام الكربوهيدرات (بسبب البنية الثانوية والثالثية للبروتين). سيساعد استخدام كمية إضافية من الإنزيم وفترات حضانة أطول، لكن هذه القيم خاصة بكل بروتين ويجب تحديدها تجريبيًا.