نيو إنجلاند بيولابس، P6044S، مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II

يحتوي مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II على جميع الإنزيمات والكواشف وعناصر التحكم اللازمة لإزالة جميع السكريات المرتبطة بالنيتروجين، بالإضافة إلى العديد من السكريات الشائعة المرتبطة بالأكسجين، من البروتينات السكرية. بعد تفاعل إزالة الغليكوزيل، تصبح العينات جاهزة للتحضير لتحليل مطياف الكتلة. الفئات ذات الصلة : إنزيمات الإكسوغليكوزيداز، إنزيمات الإندوغليكوزيداز، تطبيقات تحليل البروتينات، أنظمة التعبير، تسلسل الغليكان، هضم البروتين. المواصفات: محلول التخزين : 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 20 ملي مولار Tris-HCl، 2.6 ملي مولار EDTA، درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين المتوقف إنتاجه (NEB# P6039) ومزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II الجديد (NEB# P6044)؟ أ: يُعدّ مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II (NEB# P6044) تركيبةً جديدةً ومحسّنةً لمزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين (P6039) الذي توقف إنتاجه مؤخرًا. ويتكوّن مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II الآن من خمسة إنزيمات مُعاد تركيبها وعالية النقاء، تمّ تحسينها لإزالة الغليكوزيل من السكريات المرتبطة بروابط N و O في آنٍ واحد. يوضح الجدول أدناه التغيير الدقيق في تركيبة المنتجين: مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين (P6039) - متوقف، مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II (P6044)، إنزيم PNGase F (خالٍ من الجلسرين) (P0705)، إنزيم PNGase F (خالٍ من الجلسرين)، مُعاد التركيب (P0709)، إنزيم O-غليكوزيداز (P0733)، إنزيم O-غليكوزيداز (P0733)، إنزيم α2-3,6,8 نيورامينيداز (P0720)، إنزيم α2-3,6,8,9 نيورامينيداز A (P0722)، إنزيم β1-4 غالاكتوزيداز (P0730)، إنزيم β1-4 غالاكتوزيداز S (P0745)، إنزيم β-N-أسيتيل غلوكوزامينيداز (P0732)، إنزيم β-N-أسيتيل هيكسوزامينيداز (P0721) س: يُرفق مع مزيج إزالة الغليكوزيل البروتيني II نوعان مختلفان من محاليل التفاعل (محلول إزالة الغليكوزيل 10X، المحلول 1 والمحلول 2). كيف أعرف أي محلول أستخدم؟ ج: يُنصح باستخدام محلول إزالة الغليكوزيل 10X (B6044S) عند الحاجة إلى ظروف طبيعية (غير مُفسِّخة). يتكون محلول إزالة الغليكوزيل 10X من فوسفات الصوديوم بتركيز 500 ملي مولار، ودرجة حموضة 7.5. هذا المحلول معتدل ولا يحتوي على عوامل مُفسِّخة أو مُختزلة. في هذا النظام، يبقى البروتين السكري سليمًا بنسبة 100%. مع ذلك، تتطلب إزالة الغليكوزيل في الظروف الطبيعية عادةً كمية زائدة من الإنزيم وفترات حضانة أطول، وفي بعض الحالات قد لا تكتمل إزالة الغليكان. لذلك، عندما يكون التفسخ مقبولًا، نوصي باستخدام محلول إزالة الغليكوزيل 10X (B6045S). سيقلل هذا المحلول المنظم من كمية البروتين السكري، ولكنه سيوفر أيضًا أعلى مستوى من إزالة السكريات وأكثرها كفاءة. محلول إزالة السكريات 10X 2 متوافق مع مطياف الكتلة ولا يحتوي على كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS). راجع علامة التبويب "البروتوكولات والأدلة" للاطلاع على البروتوكول المحدد المرتبط بكل نظام محلول منظم. س: هل التحليلات اللاحقة مثل كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC) ومطياف الكتلة متوافقة مع محلول إزالة السكريات البروتيني 2؟ ج: نعم، جميع الكواشف المضمنة في محلول إزالة السكريات البروتيني 2 متوافقة مع تطبيقات كل من كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء ومطياف الكتلة. لتحضير العينات لكروماتوغرافيا السائل و/أو مطياف الكتلة، يمكن تحضير البروتين المستهدف باستخدام الغسيل الكلوي الدقيق أو الترشيح الدقيق (راجع "علم البروتينات السكرية: بروتوكولات تبادل المحاليل المنظمة"). س: جربت محلول إزالة السكريات البروتيني 2 على البروتين السكري الخاص بي ولم ألاحظ إزالة الكربوهيدرات. ما المشكلة؟ أ: يحتوي مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II على الإنزيمات اللازمة لإزالة الكربوهيدرات المرتبطة ببقايا الأسباراجين، والكربوهيدرات البسيطة المرتبطة بروابط O من النوعين 1 و3 المرتبطة بالسيرين/ثريونين، والسكريات المرتبطة بروابط O من النوعين 1 و3 المزخرفة (مع امتدادات اللاكتوزامين). يُحتمل أن تكون الكربوهيدرات مقاومة لإنزيم PNGase F (وهو أمر نادر الحدوث). يحدث هذا عندما يتم تعديل N-أسيتيل جلوكوزامين الأساسي بواسطة α1-3Fucose (يوجد غالبًا في بروتينات النباتات أو الحشرات). كذلك، ستكون السكريات المرتبطة بروابط O الممتدة بالفوكوز، وألفا-جالاكتوز، وبقايا أخرى مقاومة لهذا المزيج، ما لم تُضَف إنزيمات إكسوغليكوزيداز إضافية. يُفضّل، إن أمكن، استخدام محلول التخفيف 10X لمزيج إزالة الغليكوزيل 2 لتقليل البروتين قبل إزالة الغليكوزيل (هذا المحلول متوافق مع تحضير العينات لتحليل الطيف الكتلي). قد تمنع البنية الثانوية والثالثية للبروتينات وصول الإندوغليكوزيدازات إلى ركائزها، مما يجعل الاختزال خطوة حاسمة في عملية التحلل الفعالة. إذا كنت لا ترغب في الاختزال، فضع في اعتبارك إضافة المزيد من الإنزيم واستخدام فترات حضانة أطول. قد تتسبب العينة نفسها في تعطيل الإنزيم. تجنب استخدام محاليل العينات التي تحتوي على SDS لأن هذا المنظف يثبط إنزيمات PNGase F وO-غليكوزيداز وβ1-4 غالاكتوزيداز. قد تتسبب العينة أيضًا في انخفاض (أو ارتفاع) درجة الحموضة، خاصةً عند استخدام أحجام كبيرة (في هذه الحالات، يُفضل استبدال العينة بمحلول منظم متعادل ذي تركيز منخفض). تأكد من أن البروتين المستهدف يجب أن يكون مُغلْيكوزيليًا. قد تُشير بعض مُتنبئات الغلكزة إلى مواقع غير مشغولة في الطبيعة. كما أن أنماط الغلكزة تختلف بين الأنسجة والكائنات الحية ومراحل النمو المختلفة. وبالمثل، قد تُؤدي أنظمة التعبير المختلفة إلى بروتينات ذات تغيرات غير متوقعة في الغلكزة. أخيرًا، قد يصعب ملاحظة تغير حركة البروتين (SDS-PAGE، Western blot) (خاصةً عند إزالة كربوهيدرات صغيرة من بروتين كبير). يُنصح بإجراء تجارب تحكم سلبية جنبًا إلى جنب إن أمكن. حسّن ظروف التحميل والتشغيل لتسهيل الكشف عن التغيرات الطفيفة في الكتلة. س: ما كمية مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II التي يجب استخدامها لإزالة الكربوهيدرات في الظروف الطبيعية (غير المُفسِّخة)؟ ج: عندما لا يكون البروتين مُختزلًا أو مُفسَّخًا، قد يواجه مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II صعوبة أكبر في الوصول إلى موقع انقسام الكربوهيدرات (بسبب البنية الثانوية والثالثية للبروتين). في الظروف المُختزلة، نوصي باستخدام 5 ميكرولتر من مزيج إزالة الغليكوزيل لكل 100 ميكروغرام من البروتين. في الظروف الطبيعية، يُوصى باستخدام كمية إضافية من مزيج إزالة الغليكوزيل وفترات حضانة أطول. قد لا تُؤدي بعض البروتينات المُعقدة إلا إلى إزالة جزئية للغليكوزيل في الظروف الطبيعية، حتى بعد فترات حضانة طويلة. قد تختلف الكمية الدقيقة المطلوبة من مزيج إزالة الغليكوزيل باختلاف مستوى تعقيد كل بروتين، ويجب تحديدها تجريبيًا. س: ما هو الركيزة الضابطة المناسبة لمزيج إزالة الغليكوزيل البروتيني II؟ ج: نقترح استخدام فيتوين (NEB# P6042)، لأنه بروتين سكري يحتوي على غليكانات مرتبطة بـ N و O ومُسيَلة. يُرفق مع مزيج إزالة الغليكوزيل البروتيني II قارورة من فيتوين سعة 500 ميكروغرام. س: هل مثبطات البروتياز مقبولة للاستخدام مع تفاعل مزيج إزالة الغليكوزيل البروتيني II؟ ج: عندما يكون البروتين مُختزلًا أو مُشوهًا، يصبح أكثر عرضة للتحلل بواسطة البروتيازات. لهذا السبب، يمكن استخدام مزيج من البروتيازات يحتوي على المكونات التالية مع بروتوكول إزالة الغليكوزيل من البروتين II: أبروتينين (بتركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل)، بنزاميدين (بتركيز نهائي 1 ملي مولار)، بيبستاتين (بتركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل)، ليوبيبتين (بتركيز نهائي 1 ميكرومولار)، إي جي تي إيه (بتركيز نهائي 1 ملي مولار)، إي دي تي إيه (بتركيز نهائي 1 ملي مولار)، بي إم إس إف (بتركيز نهائي 1 ملي مولار). حضّر محلولًا مركزًا 1000 ضعف لكل مثبط في الماء، باستثناء البيبستاتين الذي يجب إذابته في الميثانول. ملاحظة: يتميز بي إم إس إف بقدرته على تعديل البقايا القاعدية على ركائز البروتين السكري.