نيو إنجلاند بيولابس، P8100S، إندوبروتياز GluC

الفئات ذات الصلة : البروتيازات، تطبيقات تحليل البروتينات، علم الجليكوميات وعلم الجليكوبروتيوميات، العلاجات الحيوية وتحليل الأجسام المضادة، هضم البروتين. مواصفات ظروف التفاعل : محلول تفاعل GluC بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول تفاعل GluC بتركيز 1X، 50 ملي مولار Tris-HCl، 0.5 ملي مولار Glu-Glu (الأس الهيدروجيني 8 عند 25 درجة مئوية). الاستخدام: التركيز 100 نانوغرام/ميكرولتر. الوزن الجزيئي النظري: 29849 دالتون. الأسئلة الشائعة : س: ما مدى استقرار/توافق إنزيم GluC الداخلي في وجود DTT، واليوريا، وتركيزات الميثانول، والأسيتونيتريل، والنيتروزوغوانيدين، والثيوريا، والجليسرول؟ ج: لا يحتوي GluC على السيستين، وبالتالي لا يتأثر بـ DTT. ينخفض ​​نشاط GluC في وجود الجليسرول. سيؤدي استخدام اليوريا بتركيز 4 مولار إلى تغيير طبيعة إنزيم GluC. يجب إجراء أي تغيير في طبيعة البروتين بمعالجة حرارية قصيرة، مثل 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. إذا لزم استخدام اليوريا بتركيز 4 مولار، فاستخدمها لتغيير طبيعة البروتين الركيزة، ثم خفف التفاعل من 10 إلى 100 ضعف قبل الهضم باستخدام GluC. قد يتحمل GluC مستويات منخفضة من النيتروزوغوانيدين أو الثيوريا؛ ومع ذلك، فكلاهما من العوامل الفوضوية، وقد يلزم اختبارهما تجريبيًا. يتوافق GluC مع 10-20% من الميثانول أو الأسيتونيتريل؛ ومع ذلك، يُفضل استخدام الأسيتونيتريل على الميثانول. عند استخدام المحاليل العضوية مع GluC، قد تختلف النتائج تبعًا لنوع البروتين الركيزة. س: كيف يمكن إجراء تجارب التحلل البروتيني المحدود باستخدام التربسين وإنزيم Glu-C؟ ما هي المواد الكيميائية التي يمكن استخدامها لإيقاف التفاعلات عند نقاط زمنية محددة لمراقبة تقدم التحلل البروتيني عبر SDS-PAGE؟ ج: على الرغم من وجود مثبطات كيميائية محددة لكل من الإنزيمين، فإن أبسط طريقة لإيقاف التفاعل (إذا كان سيتم تشغيلهما على هلام SDS-PAGE) هي إضافة محلول تحميل SDS وحضانة العينة لمدة 3 دقائق عند 95 درجة مئوية. كما يتم تعطيل إنزيمي GluC والتريبسين عن طريق خفض درجة حموضة التفاعل إلى 3. لتثبيطهما كيميائيًا، يُستخدم TLCK أو PMSF للتريبسين، و3،4-ثنائي كلورو-إيزوكومارين لإنزيم GluC. مع ذلك، فإن تفاعل 3،4-ثنائي كلورو-إيزوكومارين مع إنزيم GluC قابل للانعكاس جزئيًا وقد يكون غير مكتمل. لذلك، يُعد التمسخ باستخدام SDS هو الأفضل لتحليل الهلام، ويُنصح بإضافة 0.1% من حمض الفورميك قبل تحليل MS/MS. بشكل عام، تُعد المثبطات الكيميائية سامة وغير مستقرة، كما أنها ليست فعالة بالقدر الكافي.