نيو إنجلاند بيولابس، P8101S، تريبسين ألترا™، درجة نقاء مناسبة لتحليل الطيف الكتلي

إنزيم التربسين فائق النقاء، المُصنَّف ضمن فئة قياس الطيف الكتلي، هو إنزيم سيرين إندو ببتيداز، يقوم بقطع الروابط الببتيدية بشكل انتقائي عند الطرف الكربوكسيلي لبقايا الليسين والأرجينين. ويقطع التربسين فائق النقاء الروابط بين الليسين والبرولين، والأرجينين والبرولين، بمعدل أبطأ بكثير من معدل قطعه عند وجود الليسين والأرجينين في الطرف الأميني لبقايا أخرى. الفئات ذات الصلة : البروتيازات، تطبيقات تحليل البروتينات، علم الجليكوميات وعلم الجليكوبروتيوميات، العلاجات الحيوية وتحليل الأجسام المضادة، هضم البروتين. المواصفات : ظروف التفاعل : محلول تفاعل تريبسين ألترا 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول تفاعل تريبسين ألترا 1X، 50 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 20 ملي مولار كلوريد الكالسيوم (الأس الهيدروجيني 8 عند 25 درجة مئوية). الاستخدام: التركيز 100 نانوغرام/ميكرولتر. الوزن الجزيئي النظري: 23675 دالتون. الأسئلة الشائعة : س: هل يوجد محلول متوافق للهضم باستخدام تريبسين (P8101S) وإنزيم إندوبروتياز GluC (P8100S) معًا؟ ج: نقترح مزيجًا بنسبة 50:50 من محلول كل إنزيم. يعمل GluC بأقصى نشاط له مع ثنائي ببتيد حمض الجلوتاميك المحفز في التفاعل. يقلل كلوريد الكالسيوم من التحلل الذاتي للتريبسين. كلا المحلولين المنظمين لهما أساس من Tris-HCl عند درجة حموضة 8. لقد أجرينا عمليات هضم GluC/التريبسين بهذه الطريقة مع حضانة طوال الليل عند 37 درجة مئوية. لا يُثبط أي من الإنزيمين بمزج المحلول المنظم، لكنهما بالطبع سيهضمان بعضهما البعض إلى حد ما. س: لدي تركيز منخفض جدًا من البروتين، وأفضل عدم إجراء عملية التمسخ كخطوة منفصلة مع تبديل المحلول المنظم قبل الهضم. ما هي المواد المُفسِّخة التي يمكن استخدامها في تفاعل التريبسين نفسه؟ ج: لا يتحمل التريبسين SDS، لكنه يتحمل مستويات منخفضة (>0.01%) من معظم المنظفات غير الأيونية. كما أن تسخين البروتين إلى 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة (إذا ظل البروتين قابلاً للذوبان عند التسخين) أو وضعه في اليوريا أو الغوانيدينيوم، بتركيز لا يزيد عن 0.25 مولار لأي منهما، وإلا ستتسبب في تمسخ التريبسين نفسه، قد يُجدي نفعًا. س: أرغب في استخدام إنزيم التربسين لهضم بعض البروتينات الموجودة في سائل مزرعة الخلايا. يتكون هذا السائل من وسط DMEM مُدعّم بـ 0.2% من ألبومين المصل البقري (BSA) ومضادات حيوية. هل سيعمل الإنزيم في سائل مزرعة الخلايا؟ سيكون حجم التفاعل النهائي 100-300 ميكرولتر. ج: سيعمل إنزيم التربسين في المحلول المنظم المرفق، ولكن يمكن إجراء الهضم في أي محلول منظم تقريبًا (طالما لا يحتوي على مثبطات سيرين بروتياز) عن طريق ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8-8.5 وإضافة كلوريد الكالسيوم (CaCl2) بتركيز 10 ملي مولار. يمنع الكالسيوم التحلل الذاتي للإنزيم. عادةً لا تُمثل تراكيز الأملاح الأخرى مشكلة. نستخدم التربسين عادةً بنسبة 1:20 إلى 1:100 (إنزيم:بروتين)، لذا ستحتاج إلى تحديد تركيز البروتين التقريبي، والذي يمكن تحديده باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE أو اختبار بروتين صبغة برادفورد. إذا كان بروتين مصل الألبومين البقري (BSA) بنسبة 0.2% يُمثل الجزء الأكبر من البروتين، فسيكون تركيزه 2 ملغم/مل أو 200 ميكروغرام/100 ميكرولتر، وسيتطلب ذلك حوالي 2 إلى 10 ميكروغرام من التربسين. س: أستخدم التربسين وأتساءل عن مدى تخصصه. هل يقطع في مواقع إضافية عند التركيز العالي؟ ج: لا. س: أريد أن أعرف ما إذا كان بالإمكان الاستغناء عن الكالسيوم في المحلول المنظم لأنه يُسبب ترسب مُركب الحمض النووي-البروتين. ج: سيُحلل التربسين نفسه ذاتيًا ما لم يكن الكالسيوم موجودًا. س: أريد استخدام التربسين على 20 ميكروغرام من البروتين. ما كمية الإنزيم التي أحتاجها؟ ج: نوصي عادةً بنسبة وزن 20:1 بين الركيزة والتربسين، لذلك في هذه الحالة أضف 10 ميكرولتر من محلول التربسين المركز بتركيز 100 نانوغرام/ميكرولتر. أما بالنسبة لعلم البروتينات والتطبيقات واسعة النطاق، فنستخدم عادةً نسبة 50:1. يستخدم بعض الباحثين نسبًا تصل إلى 100:1 للحد من شظايا التربسين كملوثات في التحليل. يجب توخي الحذر عند استخدام كميات قليلة من التربسين لضمان هضم كامل. تُعد نسبة 10:1 من العينة إلى التربسين أعلى كمية يُنصح باستخدامها من التربسين. س: كيف يتم إجراء هضم التربسين داخل الهلام؟ ج: استخدم محلول هضم التربسين لإعادة ترطيب شريحة الهلام بعد تجفيفها باستخدام الأسيتونيتريل، ثم أضف كمية من التربسين إلى العينة بنسبة تتراوح بين 1:10 و1:20 وزن/وزن إنزيم:ركيزة. على سبيل المثال، يتم دمج حزمة بروتينية تُقدر بـ 1 ميكروغرام مع 50 إلى 100 نانوغرام من التربسين، ثم تُحضن عند درجة حرارة 25-37 درجة مئوية طوال الليل. نقوم عادةً بتنقية تفاعلاتنا داخل الهلام باستخدام أطراف C18 ZipTip قبل التحليل الطيفي الكتلي (MALDI-MS أو Ion Trap MS/MS). س: هل توجد طريقة بسيطة لإزالة التربسين بعد فصل البروتين؟ ج: يزيل بيزاميدين سيفاروز (الأس الهيدروجيني 8) التربسين السليم، مع العلم أنه قد تُفقد بعض الببتيدات المطلوبة خلال هذه العملية. وأفضل استراتيجية هي الحفاظ على نسبة عالية من الركيزة إلى التربسين، مثلاً 50-100:1.