نيو إنجلاند بيولابس، P8104S، إندوبروتياز AspN

إنزيم إندوبروتياز AspN (فلافاستاسين) هو إنزيم ببتيداز معدني زنكي يقوم بقطع روابط البروتين والببتيد بشكل انتقائي في الطرف الأميني لبقايا حمض الأسبارتيك. التصنيفات ذات الصلة : البروتيازات، تطبيقات تحليل البروتينات: علم الجليكوميات وعلم الجليكوبروتيوميات، العلاجات الحيوية وتحليل الأجسام المضادة، مواصفات البروتينات. شروط التفاعل : محلول تفاعل إندوبروتياز AspN بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول تفاعل إندوبروتياز AspN بتركيز 1X، 50 ملي مولار Tris-HCl، 2.5 ملي مولار ZnSO4 (الأس الهيدروجيني 8 عند 25 درجة مئوية). الاستخدام: التركيز 100 نانوغرام/ميكرولتر. الوزن الجزيئي النظري: 40089.9 دالتون. الأسئلة الشائعة : س: هل إنزيم إندوبروتياز AspN الخاص بكم هو نفسه إنزيم إندوبروتياز AspN الذي تبيعه شركات أخرى؟ ج: لا، إنه يختلف عن إنزيمات إندوبروتياز AspN الأخرى المتوفرة في السوق. فهي من مصادر سلالات مختلفة، لذا فهي إنزيمات مختلفة ذات خصائص نوعية متشابهة. يهضم إنزيم إندوبروتياز AspN من NEB البروتينات والببتيدات بسرعة، ولكنه يهضم الببتيدات بسرعة أكبر. تم توصيف إنزيم إندوبروتياز AspN من NEB لأول مرة عام 1994 بواسطة تارنتينو وآخرون، وهو موجود في قاعدة بيانات MEROPS. س: لا يذوب إنزيم إندوبروتياز AspN تمامًا عند إذابته في الماء. كيف يمكنني إذابته بالكامل؟ ج: قد يُلاحظ وجود راسب في هذا المنتج أحيانًا، ولكن لا يبدو أنه يؤثر على فعاليته. نوصي بخلطه ووضع الأنبوب على الثلج لمدة 10 دقائق، ثم تدويره سريعًا، وبعد ذلك استخدام الإنزيم حتى لو كان الراسب لا يزال موجودًا. س: ما هي البقايا التي يقطعها إنزيم إندوبروتياز AspN؟ ج: لقد لاحظنا فقط أن إنزيم الإندوبروتينيز AspN يقوم بقطع البروتينات عند بقايا الأسبارتات. س: هل لديكم بروتوكول أو إرشادات لهضم البروتينات داخل الهلام باستخدام إنزيم الإندوبروتينيز Asp-N متبوعًا بإنزيم الإندوبروتينيز Glu-C؟ أنا أتبع البروتوكول لكل منهما، لكنني أرغب في تبسيط عملية الهضم المدمجة. ج: نقترح خلط محلولي الإنزيم بنسبة 1:1 (محلول GluC:AspN). يفضل إنزيم الإندوبروتينيز GluC وجود ثنائي الببتيد EE لتحفيز نشاطه، بينما يحتاج إنزيم الإندوبروتينيز AspN إلى الزنك، الموجود في محلول AspN. مع ذلك، استخدم نسبة 1:20 (وزن/وزن) من الإنزيم إلى الركيزة لكل إنزيم. سيحدث انخفاض طفيف في قطع بروتين الركيزة نظرًا لأن الإنزيمين سيتفاعلان مع بعضهما البعض. لقد وجدنا من خلال تجربتنا أن هذه الظروف فعالة بما يكفي للحصول على درجة عالية من الهضم. قد تحتاج إلى تعديل كميات كل إنزيم على حدة في حال نقص جزء معين، بافتراض تحليل التفاعلات باستخدام تقنية قياس الطيف الكتلي. إذا كنت تفضل إجراء التفاعلات بالتتابع، فابدأ بتفاعل إنزيم إندوبروتياز GluC أولًا، لأن إنزيم إندوبروتياز AspN يواجه صعوبة في هضم البروتينات السليمة. يجب إجراء جميع عمليات الهضم عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. س: ما مدى نقاء إنزيم إندوبروتياز AspN؟ هل تم فحصه للتأكد من خلوه من نشاط النيوكلياز؟ ج: يُقدم الإنزيم في صورة متجانسة تقريبًا، وقد يكون خاليًا من النيوكليازات، ولكن لا توجد لدينا بيانات تدعم ذلك. لا يوجد لدينا حاليًا أي اختبار لمراقبة الجودة للتأكد من خلو إنزيم إندوبروتياز AspN من تلوث النيوكلياز. هذا المنتج مُصمم للاستخدام في تطبيقات البروتينات، حيث لا تُشكل النيوكليازات مشكلة في الغالب. س: هل سيتداخل Tris مع التفاعلات اللاحقة؟ هل يحتوي إنزيم الإندوبروتينيز AspN، عند إعادة تكوينه في الماء، على محلول Tris-HCl؟ ج: نعم. قبل التجفيف، يُخضع إنزيم الإندوبروتينيز AspN لعملية غسيل كلوي في محلول منظم مكون من 50 ملي مولار من كلوريد الصوديوم و10 ملي مولار من Tris-HCl. س: ما هو تسلسل إنزيم الإندوبروتينيز AspN بصيغة نصية؟ ج: إليك تسلسل الإندوبروتينيز AspN: TIVSSFIKTWPNATVYYTLPSQGSLSTQAYNTFLTNINKAFDMISSKTSV KFVQRTNQTEYITFTYSTGNSSPLGWVKNRVNGIKIYNTTYPAIIAHEIM HSMGIMHEQCRPDRDQYIIVDTNRAQDGTRHNFNLYNDYAGHGEFDFGSV MMYKSTDFAIDPNLPVMTKLDGSTFGKQRDGLSAGDYAGINHLYGPVNST SATNGTYTLTTSLAGDKNIDITGSSTADGTDVILYSATTGNNQKFIFRKS EHGYFTIKSILDSTKVLTVRNNGTANGTAVELRTNADTDAQKWLLFNLGN EGFGFAPKNAPSLRLEVKDGLTTNLTPIVIGSTDQTLQPYTKQRFTLTKVN س: هل يمكن هل يمكن استخدام إنزيم إندوبروتياز AspN مع محلول منظم متطاير؟ ج: على الأرجح نعم، ولكن يجب إضافة الزنك إلى التفاعل. س: ما مدى استقرار هذا الإنزيم؟ قمنا بإذابة الإنزيم في الماء منذ حوالي أسبوعين، وتشير المراجع إلى أن نشاطه سيبدأ بالانخفاض بعد هذه المدة من التخزين (وأكثر). ج: إنزيم إندوبروتياز AspN المخزن عند درجة حرارة -20 درجة مئوية والذي تم تجميده وإذابته أكثر من اثنتي عشرة مرة على مدار أسبوعين، يجب أن يتمتع بنشاط جيد. إنزيم إندوبروتياز AspN الذي نبيعه هو إنزيم غير مرتبط بالزنك، ويفتقر إلى الزنك اللازم لنشاطه. نضيف الزنك إلى محلولنا المنظم لإعادة تنشيط الإنزيم (وهذا ما يفسر مدة صلاحيته الطويلة). س: قمت بهضم بروتين مصل الألبومين البقري (BSA) باستخدام إنزيم إندوبروتياز AspN وفقًا للشروط القياسية، وفحصت الشظايا الناتجة باستخدام مطياف الكتلة. لم ألاحظ العديد من القمم التي تطابق الشظية المتوقعة، ولكنني لاحظت الكثير من الحزم غير المتوقعة، مما قد يشير إلى نشاط إنزيمي غير محدد. ج: من المرجح أن يكون هذا بسبب ضعف الهضم أو انعدامه، وليس بسبب الهضم غير النوعي، لأن إنزيم إندوبروتياز AspN يعمل بكفاءة عالية مع الببتيدات. كبديل، يمكنك إجراء "هضم مزدوج": هضم البروتين أولاً باستخدام التربسين أو إندوبروتياز GluC لتقليل حجمه، ثم هضمه باستخدام إنزيم إندوبروتياز AspN أو بالتزامن معه لإنتاج ببتيدات تحتوي على حمض الأسبارتيك في الطرف الأميني. س: هل يمكن تعطيل إنزيم إندوبروتياز AspN بالحرارة؟ ج: إنزيم إندوبروتياز AspN هو إنزيم فلزي يستخدم أيونات الزنك (Zn+2)، لذلك نوصي بتعطيله بإضافة EDTA بتركيز أعلى من تركيز الكاتيونات ثنائية التكافؤ الموجودة في محلول التفاعل. هذا التفاعل قابل للعكس إذا أضفت المزيد من الزنك (Zn+2) أو كاتيونات ثنائية التكافؤ أخرى تعمل على معادلة EDTA. س: لا أستطيع جعل إنزيم إندوبروتياز AspN يهضم البروتين. ج: يعمل إنزيم Endoproteinase Asp N الخاص بنا بشكل أفضل على ركائز الببتيد مقارنة بالبروتينات الكاملة، لذلك نقترح إما استخدام إنزيم آخر لتوليد ببتيدات كبيرة أولاً والتي سيواجه إنزيم Endoproteinase AspN صعوبة أقل في هضمها (هضم مزدوج باستخدام التربسين أو Endoproteinase GluC) أو التحول إلى مصدر آخر لإنزيم Endoproteinase AspN لأن إنزيم Endoproteinase AspN الخاص بنا يختلف عن المصادر التجارية الأخرى.