نيو إنجلاند بيولابس، P8107S، بروتينيز K، درجة بيولوجيا جزيئية

بروتينيز K هو بروتين سيرين بروتياز مرتبط بالسبتيليزين، يقوم بتحليل مجموعة متنوعة من الروابط الببتيدية، ويُستخدم بشكل متكرر لتنقية التفاعلات الإنزيمية أو مستخلصات الخلايا. التصنيفات ذات الصلة : البروتيازات، تنقية الأحماض النووية. مواصفات الوحدة: تعريف الوحدة: تقوم وحدة واحدة بهضم الهيموجلوبين المُشوه باليوريا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية (الأس الهيدروجيني 7.5) في الدقيقة لإنتاج امتصاص مكافئ لامتصاص 1.0 ميكرومول من L-تيروسين باستخدام كاشف فولين وسيوكالتو الفينولي (6). محلول التخزين: 20 ملي مولار Tris-HCl، 1 ملي مولار CaCl2، 50% جلسرين، درجة الحموضة 7.4 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي النظري: 28.9 كيلو دالتون. شروط اختبار الوحدة : يتم تحضين 0.5-2 ميكروغرام من بروتينيز K مع 2% من محلول الهيموغلوبين الممسوخ لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية (درجة الحموضة 7.5). بعد الترسيب والتعادل وإضافة كاشف فولين وسيوالتو الفينولي، يتم قياس امتصاص نواتج التحلل الذائبة عند 750 نانومتر. تتم مقارنة الامتصاص بمنحنى قياسي لامتصاص L-تيروسين مُحضر بطريقة مماثلة. سؤال وجواب : س: يتطلب البروتوكول الذي أستخدمه تركيزًا من بروتينيز K مقداره ميكروغرام/مل. ما هو تركيز بروتينيز K، من الدرجة المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية؟ ج: يبلغ تركيز بروتين بروتياز K، من الدرجة المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية، حوالي 20 ملغم/مل، ونشاطه 800 وحدة/مل. س: ما هو المحلول المنظم المناسب لبروتياز K؟ ج: يعمل بروتياز K في نطاق واسع من المحاليل المنظمة، بما في ذلك جميع محاليل NEBuffers الخاصة بإنزيمات التقييد، ومحلول Q5 Reaction Buffer، ومحلول OneTaq Standard Reaction Buffer، ومحلول Standard Taq Reaction Buffer، ومحلول RNAPol Reaction Buffer. يكون بروتياز K نشطًا عند درجة حموضة مثالية تتراوح بين 7.5 و12.0 (Ebeling et al., 1974) ودرجات حرارة تتراوح بين 20 و60 درجة مئوية (Bajorath et al., 1988). يتم تحفيز نشاطه بإضافة ما يصل إلى 2% من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) أو ما يصل إلى 4 مولار من اليوريا إلى التفاعل (Hilz et al., 1975). يُعدّ الكالسيوم مهمًا لثبات بروتينيز K الحراري، ولكنه ليس ضروريًا للتحفيز، ولذلك يظل بروتينيز K نشطًا حتى في المحاليل المنظمة التي تحتوي على عوامل استخلاب مثل EDTA (باجورات وآخرون، 1988). س: كيف يُمكنني تخفيف بروتينيز K، من الدرجة المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية؟ ج: للاستخدام الفوري، يُمكن تخفيف بروتينيز K في محلول منظم للتفاعل بتركيز 1X. ولتحضير محلول مركز يسمح بالتخزين طويل الأمد، يجب أن يحتوي محلول التخفيف على أيونات الكالسيوم (عادةً ما يكون تركيز 1 ملي مولار كافيًا). س: لماذا يختلف اختبار تعريف الوحدة لبروتينيز K غير المستقر حراريًا (NEB #P8111) عن اختبار تعريف الوحدة لبروتينيز K، من الدرجة المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية (NEB #P8107)؟ ج: يستخدم بروتينيز K، من الدرجة المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية (#P8107)، ركيزة هيموجلوبين مُشوهة تقليدية لقياس النشاط (1). يسمح هذا الاختبار التقليدي بمقارنة نشاط بروتينيز K بالسوق الحالي والتاريخي. على مر السنين، استُخدم الكازين أيضًا كركيزة، ولكن بدقة أقل من الهيموجلوبين. يستخدم بروتينيز K غير المستقر حراريًا (#P8111) نهجًا أكثر حداثة، حيث تُستخدم ركيزة نيتروأنيليد لقياس النشاط عن طريق الامتصاص المرئي. يُفضل هذا الاختبار لقراءته المباشرة للتحلل البروتيني، وحساسيته، وتوافقه مع صفائح 96 بئرًا. للاطلاع على تطوير الاختبار المباشر، انظر Pozgay et al. (2). المراجع: Anson, ML et al. (1938) J. Gen. Physiol., 22, 78-89. “The estimation of pepsin, trypsin, papain and cathepsin with hemoglobin.” Pozsgay, M. et al. (1979) Eur. مجلة الكيمياء الحيوية، 95، 115-119 "طريقة لتصميم ركائز ببتيدية للبروتيازات. ركائز ثلاثي ببتيديل-بارا-نيتروأنيليد لسوبتيليزين كارلسبيرغ" س: ما هو نشاط بروتينيز K، من الدرجة الجزيئية البيولوجية، عند إخضاعه لاختبار تعريف الوحدة المستخدم لبروتينيز K غير المستقر حراريًا؟ ج: يُعطي بروتينيز K، من الدرجة الجزيئية البيولوجية، تركيز نشاط يبلغ 800 وحدة/مل باستخدام اختبار نشاط الهيموجلوبين المُشوه التقليدي. بينما تُعطي العينة نفسها تركيز نشاط يبلغ حوالي 4000 وحدة/مل باستخدام اختبار نشاط الامتصاص المرئي لركيزة النيتروأنيليد الأحدث، والمستخدم لبروتينيز K غير المستقر حراريًا.