نيو إنجلاند بيولابس، P8111L، بروتينيز K غير مستقر حرارياً

إنزيم البروتينيز K غير المستقر حراريًا هو بروتينيز K مُعاد تركيبه، مُصمم للتثبيط الحراري السريع والكامل، مع نشاط بروتيني واسع النطاق، لتحليل البروتينات والإنزيمات في مستحضرات الأحماض النووية وتطبيقات أخرى. التصنيفات ذات الصلة : البروتيازات، استخلاص وتنقية الحمض النووي الريبوزي الكلي، تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) والتضخيم، تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل وتنظيف التفاعل، أدوات تحليل البروتين، هضم البروتين، تعريف وحدة القياس : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لتحرير 1.0 ميكرومول من 4-نيتروأنيلين في الدقيقة من N-سوكسينيل-ألا-ألا-برو-فينيل ألانين-p-نيتروأنيليد عند 25 درجة مئوية، في حجم تفاعل إجمالي قدره 105 ميكرولتر. محلول التخزين: 20 ملي مولار Tris-HCl، 1 ملي مولار CaCl2، 50% جلسرين، درجة الحموضة 7.4 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي الظاهري : 29 كيلو دالتون. شروط اختبار الوحدة: تُحضن سلسلة من تخفيفات بروتينيز K غير المستقر حراريًا مع 0.25 ملي مولار N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide في 0.1% SDS، 0.1% Triton X-100، 20 ملي مولار Tris-HCl، 5 ملي مولار CaCl2، 50 ملي مولار NaCl (درجة الحموضة 8.0 عند 25 درجة مئوية) في تفاعل حجمه 105 ميكرولتر. يُحضن مزيج التفاعل عند 25 درجة مئوية. يُكشف عن تحرر p-nitroaniline بواسطة مطيافية الأشعة فوق البنفسجية في الوقت الحقيقي عند 405 نانومتر. الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين بروتينيز K غير المستقر حراريًا وبروتينيز K من الدرجة المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية؟ ج: بروتينيز K غير المستقر حراريًا هو نسخة مُهندسة ومُعبَّر عنها بتقنية إعادة التركيب من بروتينيز K من الدرجة المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية (النوع البري). أنماط التحلل لكلا الإنزيمين متطابقة: فهما يُفضلان الأحماض الأمينية العطرية والأليفاتية. يمكن تعطيل بروتينيز K غير المستقر حراريًا عن طريق حضنه عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ ويحتفظ بنشاطه الأمثل بين 20 و40 درجة مئوية. س: هل يُمكنني استخدام بروتينيز K غير المستقر حراريًا في تطبيقات البيولوجيا الجزيئية؟ ج: بروتينيز K غير المستقر حراريًا خالٍ من نشاط الإكسونوكلياز والإندونوكلياز، ونشاط الريبونوكلياز، ولا يحتوي على أي تلوث قابل للكشف بالحمض النووي (بكتيري أو حقيقي النواة). لذلك، فهو مناسب تمامًا لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية وأبحاث الجينوم. س: هل يجب عليّ التبديل من بروتينيز K من الدرجة المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية إلى بروتينيز K غير المستقر حراريًا؟ ج: إذا كانت التجربة أو التطبيق يتطلب تعطيل بروتينيز K لتمكين التفاعلات اللاحقة، فإن بروتينيز K الحساس للحرارة هو الخيار الأمثل. يتيح استخدام بروتينيز K الحساس للحرارة تجنب استخلاص الفينول/الكلوروفورم أو تنقية الجل/العمود. س: إذا استبدلت بروتينيز K من الدرجة المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية ببروتينيز K الحساس للحرارة، فهل يجب استخدام نفس كمية الإنزيم؟ ج: في معظم التطبيقات، يمكن استخدام نفس حجم بروتينيز K الحساس للحرارة بدلاً من بروتينيز K من الدرجة المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية. هذه نقطة بداية جيدة؛ ومع ذلك، قد تعتمد الكمية الدقيقة للإنزيم المطلوبة على الركيزة وقد يلزم اختبارها تجريبياً. س: كيف يمكنني تعطيل بروتينيز K الحساس للحرارة بالحرارة؟ ج: في معظم سير العمل، يمكن تعطيل بروتينيز K الحساس للحرارة بالحرارة عن طريق حضنه عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. مع ذلك، تتأثر حساسية الإنزيم للحرارة بتركيز الملح، ودرجة الحموضة، وتركيز أيونات المعادن الموجودة في مزيج التفاعل. لذا، قد يلزم تحديد درجة حرارة التثبيط المثلى ووقت الحضانة تجريبيًا لكل إجراء على حدة. س: ما هو المحلول المنظم الذي يجب استخدامه لتخفيف بروتينيز K الحساس للحرارة؟ ج: قد تعتمد كمية بروتينيز K الحساس للحرارة المطلوبة على الركيزة. مع ذلك، فإن ظروف التفاعل النموذجية هي 1 ميكرولتر من الإنزيم لكل 50 ميكرولتر من حجم التفاعل. المحلول المنظم الموصى به للتخفيف هو 20 ملي مولار من Tris-HCl، و1 ملي مولار من CaCl2، ودرجة حموضة 7.5. س: ما هو المحلول المنظم الأمثل لتفاعل بروتينيز K الحساس للحرارة؟ ج: يتوافق بروتينيز K الحساس للحرارة مع مجموعة واسعة من المحاليل المنظمة: درجة الحموضة المثلى: 7-10، الملح: 0-1 مولار من NaCl، المحلول المنظم: Tris-HCl، HEPES، Tricine، وTris-Acetate. يوضح الجدول أدناه النشاط النسبي في المحاليل المنظمة الشائعة. محلول منظم 1X NEB1.1 + NEB2.1 + NEB3.1 + CutSmart +++ محلول منظم Q5 +++ Q5 HighGC + Thermopol + T4 DNA Ligase ++ س: ما هي درجة حرارة ووقت الحضانة الأمثل؟ ج: يتراوح نطاق درجة حرارة الحضانة الموصى به بين 20 و40 درجة مئوية. بالنسبة للحضانة التي تزيد مدتها عن ساعة واحدة، نوصي بـ 25 درجة مئوية. يعتمد وقت الحضانة على الركيزة ويختلف بناءً على سبب التحلل البروتيني. عادةً، للقضاء على نشاط الإنزيم، تكون الحضانة لمدة 5-10 دقائق كافية. ومع ذلك، قد يستغرق الأمر وقتًا أطول إذا كانت هناك حاجة إلى تحلل الخلايا، أو تحطيم النيوكليوسومات، أو شطر الهستونات، أو في حالة وجود بروتينات أخرى. س: هل بروتينيز K غير المستقر حراريًا متوافق مع EDTA، وTriton X-100، وSDS، وDTT، و/أو اليوريا؟ ج: نعم. إنزيم البروتينيز K غير المستقر حراريًا يكون نشطًا تمامًا في وجود 10 ملي مولار من EDTA، و1.5% من Triton X-100، و2.5% من SDS، و10 ملي مولار من DTT، و1 مولار من اليوريا. نوصي بالبقاء عند هذه الكميات أو أقل منها لكل مكون. س: هل إنزيم البروتينيز K غير المستقر حراريًا نشط في محاليل NEB الشائعة؟ ج: نعم، إنزيم البروتينيز K غير المستقر حراريًا نشط في محاليل NEBuffer 1.1 و2.1 و3.1 وCutSmart® ومحلول تفاعل T4 DNA Ligase. أما المحاليل الأخرى، فيجب اختبارها تجريبيًا. س: هل إنزيم البروتينيز K غير المستقر حراريًا نشط في وجود أيونات المعادن؟ ج: إنزيم البروتينيز K غير المستقر حراريًا نشط في وجود 10 ملي مولار من CaCl2 و10 ملي مولار من MgCl2. س: لماذا يختلف اختبار تعريف الوحدة لبروتينيز K غير المستقر حراريًا (NEB #P8111) عن اختبار تعريف الوحدة لبروتينيز K، من الدرجة البيولوجية الجزيئية (NEB #P8107)؟ ج: يستخدم بروتينيز K، من الدرجة البيولوجية الجزيئية (#P8107) ركيزة هيموجلوبين تقليدية مُشوهة لقياس النشاط (1). يسمح هذا الاختبار التقليدي بمقارنة نشاط بروتينيز K بالسوق الحالية والتاريخية. على مر السنين، استُخدم الكازين أيضًا كركيزة، ولكن بدقة أقل من الهيموجلوبين. يستخدم بروتينيز K غير المستقر حراريًا (#P8111) نهجًا أكثر حداثة، حيث تُستخدم ركيزة نيتروأنيليد لقياس النشاط عن طريق الامتصاص المرئي. يُفضل هذا الاختبار لقراءته المباشرة للتحلل البروتيني، وحساسيته، وتوافقه مع لوحة 96 بئرًا. للاطلاع على تطوير الاختبار المباشر، انظر Pozgay et al. (2). المراجع: Anson, ML et al. (1938) مجلة علم وظائف الأعضاء العامة، 22، 78-89. "تقدير البيبسين، والتربسين، والباباين، والكاتيبسين باستخدام الهيموجلوبين." بوزجاي، م. وآخرون. (1979) المجلة الأوروبية للكيمياء الحيوية، 95، 115-119 "طريقة لتصميم ركائز ببتيدية للبروتيازات. ركائز ثلاثي ببتيديل-بارا-نيتروأنيليد لسوبتيليزين كارلسبيرج". س: ما هو نشاط بروتينيز K، من الدرجة الجزيئية البيولوجية، إذا خضع لاختبار تعريف الوحدة المستخدم لبروتينيز K غير المستقر حراريًا؟ ج: يُعطي بروتينيز K، من الدرجة الجزيئية البيولوجية، تركيز نشاط يبلغ 800 وحدة/مل باستخدام اختبار نشاط الهيموجلوبين الممسوخ التقليدي. وتعطي نفس العينة تركيز نشاط يبلغ حوالي 4000 وحدة/مل باستخدام فحص النشاط بالامتصاص المرئي لركيزة النيتروأنيليد الأكثر حداثة والذي يستخدم لبروتينيز K غير المستقر حرارياً.