نيو إنجلاند بيولابس، P8112S، بروتياز TEV

إن تسلسل التعرف على بروتياز TEV ذو أعلى كفاءة تحفيزية هو ENLYFQ ▼S؛ ومع ذلك، يمكن أن يكون الحمض الأميني في الموضع P1' هو G أو A أو M أو C أو H (1). الفئات ذات الصلة: نظام دمج وتنقية بروتين MBP من NEBExpress، التعبير عن البروتين في بكتيريا الإشريكية القولونية، تنقية النيكل (علامة الهيستيدين)، تطبيقات: شطر بروتين الدمج، عدم ذوبان البروتين المستهدف، تنقية البروتين، تعريف وحدة المواصفات : وحدة واحدة من بروتياز TEV تشطر 2 ميكروغرام من بروتين MBP المدمج، MBP5-TEV-paramyosin ΔSal، بنسبة اكتمال 95% في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر في ساعة واحدة عند 30 درجة مئوية في محلول Tris-HCl بتركيز 50 ملي مولار (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية) مع 0.5 ملي مولار EDTA و1 ملي مولار DTT. شروط التفاعل: محلول تفاعل بروتياز TEV بتركيز 1X، يُحضن عند درجة حرارة 30 درجة مئوية. محلول تفاعل بروتياز TEV بتركيز 1X: 50 ملي مولار Tris-HCl، 0.5 ملي مولار EDTA، 1 ملي مولار DTT (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين : 50 ملي مولار Tris-HCl، 250 ملي مولار NaCl، 1 ملي مولار TCEP، 1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الوزن الجزيئي الظاهري : 28 كيلو دالتون . شروط فحص الوحدة: يتم تحضين تخفيفات متسلسلة من بروتياز TEV مع 2 ميكروغرام من MBP5-TEV-paramyosin ΔSal ومحلول تفاعل بروتياز TEV بتركيز 1X في تفاعل حجمه 10 ميكرولتر. يُحضن مزيج التفاعل عند درجة حرارة 30 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. تُفحص نواتج التفاعل باستخدام تقنية SDS-PAGE. الأسئلة الشائعة : س: هل يستطيع إنزيم TEV Protease التعرف على تسلسل آخر غير Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser) وقطعه؟ ج: تسلسل التعرف على إنزيم TEV Protease ذو أعلى كفاءة تحفيزية هو ENLYFQ▼S. مع ذلك، يمكن أن يكون الحمض الأميني في الموضع P1' هو G أو A أو M أو C أو H (1). Kapust, RB et al. (2002) Biochem. and Biophysical Research Comm. 294, 949-955. س: هل من الضروري إجراء غسيل كلوي للعينة قبل القطع باستخدام إنزيم TEV Protease؟ ج: إذا احتوت عينة البروتين المدمج على أكثر من 2 مولار من اليوريا، أو أكثر من 0.5 مولار من هيدروكلوريد الغوانيدين، أو أكثر من 50 ملي مولار من الإيميدازول، أو قيم أس هيدروجيني أقل من 6 أو أعلى من 9، أو مثبطات بروتياز السيستين، فسيكون من الضروري إجراء غسيل كلوي للبروتين المدمج قبل فصله بواسطة بروتياز TEV. س: هل يمكن استخدام بروتياز TEV في درجات حرارة منخفضة؟ ج: نعم، يمكن استخدام بروتياز TEV في درجات حرارة أقل من 30 درجة مئوية. يتطلب الفصل في درجات حرارة منخفضة، مثل 4 درجات مئوية، حضانة طوال الليل. س: هل يتوافق بروتياز TEV مع مثبطات البروتياز؟ ج: لا تتأثر فعالية بروتياز TEV بمثبطات البروتياز التالية: أبروتينين، بنزاميدين، ليوبيبتين، بيبستاتين، وPMSF. س: هل يتوافق بروتياز TEV مع محاليل التفاعل المختلفة؟ ج: يُعد محلول التفاعل الأمثل هو محلول تفاعل بروتياز TEV المُرفق بتركيز 10X (0.5 مولار Tris-HCl، درجة حموضة 7.5، 5 ملي مولار EDTA، 10 ملي مولار DTT). مع ذلك، يكون الإنزيم نشطًا أيضًا في محاليل HEPES، وفوسفات البوتاسيوم، وأسيتات الصوديوم عند درجات حموضة تتراوح بين 6 و9. س: هل يمكن إزالة بروتياز TEV من التفاعل بعد عملية الفصل؟ ج: نعم، يحتوي بروتياز TEV على علامة بولي هيستيدين في طرفه الأميني. بعد فصل البروتين المدمج، يُزال بروتياز TEV من تفاعل الفصل باستخدام كروماتوغرافيا تقارب المعادن المُثبتة.