نيو إنجلاند بيولابس، P8113S، بروتياز ألفا-لايتيك

يقوم إنزيم ألفا-لايتيك بروتياز (aLP) بفصل البروتينات بعد بقايا الثريونين (T) والألانين (A) والسيرين (S) والفالين (V). تجعله خصوصيته إنزيمًا بديلًا ومستقلًا عن غيره من الإنزيمات البروتينية الشائعة الاستخدام في تطبيقات علم البروتينات، بما في ذلك التربسين والكيموتريبسين. التصنيفات ذات الصلة : الإنزيمات البروتينية، تطبيقات تحليل البروتينات، أدوات تحليل البروتينات، هضم البروتينات، علم البروتينات. المواصفات : محلول التخزين : أسيتات الصوديوم 10 ملي مولار، درجة الحموضة 5، عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 95 درجة مئوية. الوزن الجزيئي الظاهري : 19860 دالتون. الأسئلة الشائعة : س: ما هي محاليل التفاعل الموصى بها للاستخدام مع إنزيم ألفا-لايتيك بروتياز؟ ج: إنزيم ألفا-لايتيك بروتياز نشط في مجموعة متنوعة من المحاليل المنظمة، بما في ذلك بيكربونات الأمونيوم، وتريس-هيدروكلوريد، وهيبس. يتراوح الرقم الهيدروجيني الأمثل لهضم البروتين بواسطة إنزيم ألفا-لايتيك بروتياز بين 7.5 و8.5. يُنصح باستخدام محلول بيكربونات الأمونيوم لتحليل مطياف الكتلة اللاحق. س: هل يُمكنني إجراء عملية الهضم باستخدام إنزيم ألفا-لايتيك بروتياز عند درجات حرارة أخرى غير 37 درجة مئوية؟ ج: نعم، إنزيم ألفا-لايتيك بروتياز نشط بين 4 و50 درجة مئوية. قد تكون هناك حاجة إلى فترات حضانة أطول لعمليات الهضم عند درجات حرارة منخفضة. يتراوح وقت الهضم الموصى به عند 37 درجة مئوية من ساعة إلى 18 ساعة، وذلك حسب نوع الركيزة ودرجة الهضم المطلوبة. س: لماذا يُفضل استخدام إنزيم ألفا-لايتيك بروتياز بدلاً من التربسين؟ ج: قد يكون إنزيم ألفا-لايتيك بروتياز أكثر كفاءة في هضم البروتينات التي تحتوي على مناطق كارهة للماء كبيرة أو البروتينات المرتبطة بالغشاء مقارنةً بالتربسين، مما يوفر تغطية تسلسلية مُحسّنة ويسمح بتحديد التعديلات اللاحقة للترجمة الجديدة. س: هل هناك فائدة من معالجة العينة باستخدام كلٍ من بروتياز ألفا-لايتيك والتريبسين؟ ج: نعم. يؤدي التقطيع الموضعي بعد بقايا الليسين والأرجينين بواسطة التريبسين إلى تكوين ببتيدات موجبة الشحنة، ولكنها قد تكون كبيرة جدًا بحيث لا يمكن الكشف عنها باستخدام مطياف الكتلة. يؤدي إجراء هضم مزدوج للركيزة باستخدام التريبسين وبروتياز ألفا-لايتيك إلى تكوين ببتيدات أصغر، مما يزيد من تغطية التسلسل واحتمالية تحديد تعديلات ما بعد الترجمة الجديدة. س: ما هي الكواشف التي تثبط نشاط بروتياز ألفا-لايتيك؟ ج: يتم تثبيط نشاط بروتياز ألفا-لايتيك بواسطة: 1.0% ديوكسيكولات الصوديوم: حوالي 60% نشط، 0.1% SDS: حوالي 50% نشط، 1% SDS: 40% نشط، 1 مولار هيدروكلوريد الغوانيدين: حوالي 20% نشط، 4 مولار هيدروكلوريد الغوانيدين: لا يوجد نشاط، مثبطات بروتياز السيرين، مثل PMSF: لا يوجد نشاط. س: ما هي الكواشف التي تحفز نشاط بروتياز ألفا-لايتيك؟ ج: يتم تحفيز نشاط بروتياز ألفا-لايتيك في محلول ديوكسيكولات الصوديوم بتركيز يصل إلى 0.1%. س: هل يمكن تعطيل بروتياز ألفا-لايتيك بالحرارة؟ ج: نعم. يمكن تعطيل بروتياز ألفا-لايتيك بالحرارة عن طريق الحضانة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الحضانة عند 70 درجة مئوية تقضي على حوالي 50% فقط من النشاط الإنزيمي.