نيو إنجلاند بيولابس، P8115S، NEBExpress® T4 لايزوزيم

الفئات ذات الصلة : الخلايا المؤهلة، سلالات التعبير عن البروتين في الإشريكية القولونية، تطبيقات التعبير عن البروتين، التعبير عن البروتين في الإشريكية القولونية، مواصفات التعبير عن البروتين، محلول التخزين: 50 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار NaCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 0.03% بولوكسامر 188، 50% جلسرين، درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية. الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين NEBExpress® T4 Lysozyme و lysozyme الموجود في بياض بيض الدجاج؟ ج: NEBExpress® T4 Lysozyme هو بروتين مُعاد التركيب أكثر نشاطًا بحوالي 200 ضعف من lysozyme الموجود في بياض بيض الدجاج عند استخدامه في نفس الظروف. لذلك، يلزم كمية أقل بكثير من T4 Lysozyme لتحليل الإشريكية القولونية في محلول Tris. يحتوي كل 1 مل من خلايا الإشريكية القولونية على حوالي 1 ميكروغرام من إنزيم الليزوزيم T4، مقابل حوالي 0.1 إلى 0.5 ملغ من الليزوزيم الموجود في بياض بيض الدجاج لكل 1 مل من خلايا الإشريكية القولونية. يبلغ الوزن الجزيئي لإنزيم NEBExpress® T4 Lysozyme 18.7 كيلو دالتون، بينما يبلغ الوزن الجزيئي لليزوزيم الموجود في بياض بيض الدجاج 14.3 كيلو دالتون. س: هل يمكنني استخدام NEBExpress® T4 Lysozyme لاستخلاص الحمض النووي DNA أو RNA؟ ج: نعم. لا يحتوي NEBExpress® T4 Lysozyme على أي نشاط نوكلياز داخلي أو خارجي أو RNase أو DNase قابل للكشف، ولذلك يُوصى باستخدامه لاستخلاص الحمض النووي DNA وRNA. س: ما هي المحاليل المنظمة المتوافقة مع NEBExpress® T4 Lysozyme؟ ج: يتوافق NEBExpress® T4 Lysozyme مع محاليل Tris-HCl وHEPES والمحاليل المنظمة القائمة على فوسفات الصوديوم. يتميز هذا الإنزيم بنطاق حموضة مثالي يتراوح بين 7.5 و8.5، ويمكن إضافة كميات منه أقل من 25 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، وأقل من 2 ملي مولار من الإيثيلين ديامين رباعي حمض الأسيتيك (EDTA)، وأقل من 1 ملي مولار من كلوريد المغنيسيوم، وتوين 20 أو تريتون X-100 بنسبة أقل من 2%. كما يتوافق الإنزيم مع عوامل الاختزال مثل ثنائي ثيوثريتول (DTT)، وبيتا-ميركابتوإيثانول، وTCEP، وTHP. وللحصول على أفضل نشاط لإنزيم T4 Lysozyme، يُنصح باستخدام أحد الخيارين التاليين: 1 ميكرولتر من NEBExpress T4 Lysozyme (1 ميكروغرام من الإنزيم) لكل 1 مل من الخلايا المُعلقة في محلول Tris-HCl بتركيز 50 ملي مولار ودرجة حموضة 7.5، وEDTA بتركيز 0.5 ملي مولار. أو 0.1 ميكرولتر من NEBExpress T4 Lysozyme لكل 1 مل من الخلايا المُعلقة في محلول تحلل بكتيريا الإشريكية القولونية NEBExpress® (NEB #P8116S). لاحظ أن تركيزات EDTA ≥ 2 ملي مولار، وNaCl > 25 ملي مولار، وMgCl2 > 1 ملي مولار ستبدأ بتثبيط نشاط الإنزيم، مع فقدان 50% من النشاط عند تركيز EDTA 5 ملي مولار، و80% عند تركيز NaCl 50 ملي مولار، و80% عند تركيز MgCl2 5 ملي مولار. س: هل يمكن استخدام عوامل الاختزال عند التحلل باستخدام إنزيم NEBExpress® T4 Lysozyme؟ ج: نعم، إنزيم NEBExpress® T4 Lysozyme متوافق مع عوامل الاختزال الشائعة الاستخدام، بما في ذلك β-ميركابتوإيثانول، وDTT، وTCEP، وTHP. ولتنقية المنتج لاحقًا، وعلى عكس الموردين الآخرين، فإن أعمدة الطرد المركزي بالنيكل من NEBExpress® (NEB #S1427) وراتنج النيكل من NEBExpress® (NEB #S1428) مقاومة كيميائيًا لهذه العوامل المختزلة. س: هل يُمكن تخفيف إنزيم NEBExpress® T4 Lysozyme قبل إضافته إلى الخلايا المُعلقة؟ ج: نعم، إذا لزم استخدام كمية صغيرة جدًا من إنزيم NEBExpress® T4 Lysozyme، يُمكن تخفيفه في محلول Tris-HCl بتركيز 50 ملي مولار ودرجة حموضة 7.5. س: ما هي درجة حرارة ووقت الحضانة الأمثل لتحليل الخلايا باستخدام إنزيم NEBExpress® T4 Lysozyme؟ ج: يجب تحليل الخلايا باستخدام إنزيم T4 Lysozyme في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية لمدة 5-10 دقائق مع رج خفيف. لا يُنصح بالحضانة عند 37 درجة مئوية لتجنب احتمال تحفيز نشاط البروتياز. س: هل إنزيم NEBExpress® T4 Lysozyme فعال على الكائنات الحية الأخرى غير الإشريكية القولونية؟ ج: نعم، إنزيم NEBExpress® T4 Lysozyme قادر على تحليل أنواع أخرى من البكتيريا سالبة الغرام بكفاءة، مثل Vibrio natriegens وSalmonella typhimurium وPseudomonas putida وXanthomonas malvacearum وRalstonia eutropha وFlavobacterium johnsoniae، بالإضافة إلى جميع سلالات E. coli المُعبَّر عنها والمتوفرة في كتالوج NEB. كما أنه فعال ضد بعض أنواع البكتيريا موجبة الغرام، مثل بعض سلالات Bacillus (مثل B. subtilis وB. thuringiensis). يُرجى ملاحظة أنه قد يلزم استخدام كمية أكبر من إنزيم NEBExpress® T4 Lysozyme بمقدار 5 إلى 15 ضعفًا لتحقيق التحلل مع سلالة غير E. coli. س: بعد حضانة المحلول مع إنزيم NEBExpress® T4 Lysozyme، أصبح المحلول لزجًا؛ كيف يُمكنني حل هذه المشكلة؟ ج: ينتج المحلول اللزج عن وفرة الحمض النووي المُحرَّر. لتقليل اللزوجة، تتوفر ثلاثة خيارات: أولاً، قص الحمض النووي بتعريض المستخلص لنبضتين من جهاز الموجات فوق الصوتية. ثانياً، إضافة 1 ملي مول من كلوريد الكالسيوم و1 ميكرولتر من نوكلياز المكورات الدقيقة (NEB #M0247S) لكل 1 مل من المستخلص، ثم الخلط والحضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثالثاً، إضافة 1 ميكرولتر من ديوكسي ريبونيوكلياز I (NEB #M0303S) لكل 1 مل من المستخلص و1 ملي مول من كلوريد الكالسيوم أو 1 ملي مول من كلوريد المغنيسيوم (خاصةً إذا كان المعلق يحتوي على EDTA)، ثم الخلط والحضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إنزيم DNase I من NEB مُوسَم ببروتين رابط للمالتوز (MBP)، مما يجعل إزالته باستخدام راتنج الأميلوز (NEB #E8021)، أو راتنج الأميلوز عالي التدفق (NEB #E8022)، أو حبيبات الأميلوز المغناطيسية (NEB #E8035) عمليةً بسيطةً وفعّالة. س: هل يجب تجميد كريات الخلايا قبل تحليلها باستخدام إنزيم NEBExpress® T4 Lysozyme؟ ج: التجميد غير ضروري؛ ومع ذلك، قد تزيد كريات الخلايا المجمدة من كفاءة التحليل. س: هل يمكنني استخدام إنزيم NEBExpress® T4 Lysozyme في اختبار نشاط الليزوزيم القياسي باستخدام ركيزة فلورية (4-ميثيل أومبيليفيرون)؟ ج: لا. يقوم إنزيم NEBExpress T4 Lysozyme بتحليل ركيزة عديد السكاريد فقط، والمكونة من سلسلة من N-أسيتيل جلوكوزامين (GlcNAc) وN-أسيتيل موراميك أسيد (MurNAc) المرتبطة بروابط β-1 → 4، عند ارتباطها بسلسلة ببتيدية خماسية. ركيزة عديد السكاريد الخطية الخالية من الببتيدات ليست ركيزة لإنزيم NEBExpress T4 Lysozyme. س: هل إنزيم NEBExpress T4 Lysozyme موسوم؟ ج: لا. هذا الإنزيم غير موسوم. ومع ذلك، نظرًا لارتفاع نقطة التعادل الكهربائي (pI) الخاصة به (9.576)، فإنه يُزال بسهولة بواسطة راتنج التبادل الكاتيوني.