نيو إنجلاند بيولابس، P8116S، كاشف تحلل الإشريكية القولونية NEBExpress®

فئات ذات صلة بـ NEBExpress: الخلايا المؤهلة، التطبيقات، حلول الاستنساخ والأتمتة عالية الإنتاجية، التعبير عن البروتين في الإشريكية القولونية، أسئلة شائعة حول التعبير عن البروتين: س: ما هي كمية كاشف تحلل الإشريكية القولونية NEBExpress® التي يجب استخدامها؟ ج: نوصي باستخدام 5 مل من كاشف تحلل الإشريكية القولونية NEBExpress لكل 1 غرام من الخلايا. بدلاً من ذلك، يمكن حساب حجم كاشف التحلل بناءً على عدد وحدات الامتصاص الضوئي عند 600 نانومتر (UOD600) التي تم جمعها، حيث UOD600 هي قيمة الامتصاص الضوئي عند 600 نانومتر للمزرعة مضروبة في حجمها الكلي. على سبيل المثال، إذا تم جمع مزرعة حجمها 5 مل عندما كانت قيمة الامتصاص الضوئي عند 600 نانومتر تساوي 1.0، فإن 5 مل × 1.0 = 5 وحدات UOD600. يُنصح باستخدام 0.025-0.075 مل من كاشف التحلل لكل وحدة UOD600 مُستخلصة، لذا في المثال أعلاه، يلزم 0.125-0.375 مل. س: لماذا أرى ترسبات في كاشف تحلل الإشريكية القولونية NEBExpress®؟ ج: قد يؤدي استخدام كاشف التحلل أو تخزينه في درجات حرارة أقل من 4 درجات مئوية إلى ترسب المنظفات. لإذابة الترسبات، اترك الكاشف حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة ثم اخلطه. س: هل يمكنني استخدام كاشف تحلل الإشريكية القولونية NEBExpress® المُجمد؟ ج: نعم، اتركه حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة ثم اخلطه. س: هل يجب تبريد كاشف تحلل الإشريكية القولونية NEBExpress® قبل الاستخدام؟ ج: لا، يكون استخلاص البروتين أكثر فعالية عندما تكون درجة حرارة الكاشف بين 15 و30 درجة مئوية (درجة حرارة الغرفة). تبريد الكاشف قبل الاستخدام سيؤدي إلى ترسب المنظفات، مما ينتج عنه استخلاص غير كامل للبروتين. س: هل يجب تجميد كريات الخلايا قبل تحليلها باستخدام كاشف تحليل الإشريكية القولونية NEBExpress®؟ ج: التجميد ليس ضروريًا؛ ومع ذلك، قد يؤدي تجميد كريات الخلايا إلى زيادة كفاءة استخلاص البروتين. س: ما هو المحلول المنظم الموجود في كاشف تحليل الإشريكية القولونية NEBExpress®؟ ج: كاشف تحليل الإشريكية القولونية NEBExpress® هو محلول منظم قائم على Tris بدرجة حموضة 7.5. س: هل يمكنني إضافة كلوريد الصوديوم إلى كاشف تحليل الإشريكية القولونية NEBExpress®؟ ج: نعم، يتوافق كاشف تحليل الإشريكية القولونية NEBExpress® مع تركيزات كلوريد الصوديوم ≤ 1 مولار. التركيزات الأعلى ستؤدي إلى الترسيب. مع ذلك، عند استخدامه مع إنزيم NEBExpress® T4 Lysozyme (NEB #P8115)، يجب ألا يتجاوز تركيز كلوريد الصوديوم 25 ملي مولار. وعند استخدامه مع إنزيم Micrococcal Nuclease (NEB #M0247S) أو DNase I (NEB #M0303)، يجب ألا يتجاوز تركيز كلوريد الصوديوم 100 ملي مولار. في حال الحاجة إلى تركيز أعلى من كلوريد الصوديوم، يجب تعديله بعد إجراء عملية التحلل. س: هل يمكنني تغيير درجة حموضة كاشف تحلل الإشريكية القولونية NEBExpress®؟ ج: نعم، يمكنك استخدام محلول منظم قائم على Tris أو PIPPS أو الفوسفات لمعايرة درجة الحموضة بين 5.5 و10. ستؤدي قيم الحموضة الأقل من 5.5 إلى ترسب مكونات الكاشف. س: هل كاشف تحلل الإشريكية القولونية NEBExpress® متوافق مع EDTA؟ ج: نعم، لمنع التداخل مع راتنجات الألفة المعدنية، استخدم تركيزًا أقل من 0.1 ملي مولار من EDTA. عند استخدام راتنج النيكل NEBExpress (NEB #S1428S) أو أعمدة النيكل الدوارة (NEB #S1427S/L)، لا داعي للقلق بشأن تركيز EDTA، لأن الراتنج في هذه المنتجات مقاوم كيميائيًا لتفاعل EDTA. عند استخدام إنزيم الليزوزيم T4 NEBExpress® (NEB #P8115) مع كاشف تحلل الإشريكية القولونية NEBExpress®، نوصي باستخدام تركيز أقل من 2 ملي مولار من EDTA. س: هل يمكنني إضافة مثبط بروتياز إلى تفاعل كاشف تحلل الإشريكية القولونية NEBExpress®؟ ج: نعم، ولكن اختر مثبط بروتياز متوافقًا مع أي معالجة لاحقة ضرورية للبروتين المطلوب. عند استخدام العامل Xa (NEB #P8010) أو إنتيروكيناز (NEB #P8070) أو ثرومبين، تجنب استخدام مثبطات سيرين بروتياز. في حال استخدام بروتياز TEV (NEB #P8112)، تجنب استخدام مثبطات بروتياز السيستين. في حال استخدام إنزيمات و/أو بروتيازات تعتمد على المعادن، تجنب استخدام EDTA/EGTA. س: هل أحتاج إلى إضافة الليزوزيم للمساعدة في التحلل؟ ج: على الرغم من أنه ليس ضروريًا دائمًا، إلا أن إضافة الليزوزيم ستحسن كفاءة الاستخلاص. أضف 1 ميكرولتر من NEBExpress® T4 Lysozyme (NEB #P8115) لكل 1 مل من المحلول. قد يصبح المحلول لزجًا ويتطلب إضافة 200-2000 وحدة/مل من نوكلياز المكورات الدقيقة (NEB #M0247S) أو 10-100 وحدة/مل من DNase I (NEB #M0303) بوجود 1 ملي مول من CaCl2. س: محلولي لزج؛ كيف يمكنني حل هذه المشكلة؟ ج: ينتج عن وفرة الحمض النووي (DNA) المُحرر بواسطة كاشف التحلل مُستخلص لزج. أضف 200-2000 وحدة/مل من نوكلياز المكورات الدقيقة (NEB #M0247S) أو 10-100 وحدة/مل من ديوكسي ريبونيوكلياز I (NEB #M0303) بوجود 1 ملي مول من كلوريد الكالسيوم (CaCl2). يُوصى بإجراء اختبار تحلل على نطاق صغير باستخدام كاشف التحلل لتحديد ما إذا كان نوكلياز المكورات الدقيقة أو ديوكسي ريبونيوكلياز I ضروريًا، ثم زيادة الكمية تدريجيًا. إن ديوكسي ريبونيوكلياز I من NEB مُدمج مع بروتين ربط المالتوز (MBP)، مما يجعل إزالته عبر راتنج الأميلوز (NEB #E8021)، أو راتنج الأميلوز عالي التدفق (NEB #E8022)، أو حبيبات الأميلوز المغناطيسية (NEB #E8035) أمرًا بسيطًا وفعالًا. س: هل يُمكنني استخدام عامل مُختزل مع كاشف تحلل الإشريكية القولونية NEBExpress®؟ ج: نعم، يتوافق كاشف تحلل الإشريكية القولونية NEBExpress مع جميع عوامل الاختزال الشائعة الاستخدام، بما في ذلك بيتا-ميركابتوإيثانول، وDTT، وTCEP، وTHP. للتنقية اللاحقة، تتميز أعمدة الطرد المركزي النيكل NEBExpress® (NEB #S1427) وراتنج النيكل NEBExpress® (NEB #S1428) بمقاومتها الكيميائية لهذه العوامل المختزلة؛ أما راتنجات تقارب المعادن المثبتة (مثل النيكل أو الكوبالت) من موردين آخرين فقد لا تكون كذلك، لذا يُرجى مراجعة المورد واختيار عامل اختزال مناسب. س: هل يُحلل كاشف تحلل الإشريكية القولونية NEBExpress® خلايا البكتيريا موجبة الجرام أو خلايا الخميرة؟ ج: يُحلل كاشف تحلل الإشريكية القولونية NEBExpress® بعض أنواع البكتيريا موجبة الجرام، مثل بعض سلالات العصوية (العصوية الرقيقة، والعصوية التورنجية). يُنصح بشدة بإضافة إنزيم الليزوزيم T4 من NEBExpress® (NEB #P8115) وإنزيم النيوكلياز الميكروكوكي (NEB #M0247S) للحصول على أفضل تحلل للبكتيريا موجبة الجرام. يُظهر كاشف تحلل الإشريكية القولونية NEBExpress® فعالية محدودة على خلايا الخميرة. س: هل يُحلل كاشف تحلل الإشريكية القولونية NEBExpress® خلايا البكتيريا سالبة الجرام؟ ج: نعم، لقد اختبرنا وأكدنا تحلل البكتيريا سالبة الجرام التالية: Vibrio natriegens، Salmonella typhimurium، Pseudomonas putida، Xanthomonas malvacearum، Ralstonia eutropha، Flavobacterium johnsoniae، وجميع سلالات التعبير عن الإشريكية القولونية المتوفرة في كتالوج NEB. س: يُكوّن البروتين الخاص بي أجسامًا مُتضمنة. هل يُمكنني استخدام هذا الكاشف لتحليل خلاياي؟ ج: نعم، وسيساعد كاشف تحلل الإشريكية القولونية NEBExpress® على إزالة الأجسام المدمجة. س: هل يمكنني إضافة كاشف تحلل الإشريكية القولونية NEBExpress® مباشرةً إلى مزرعة الخلايا لتحليلها؟ ج: نعم، نوصي باستخدام نسبة 1:1 من كاشف التحلل إلى مزرعة الخلايا، أو إلى الخلايا المغسولة والمُركّزة في محلول منظم مناسب، بشرط أن يكون المحلول متوافقًا مع الخطوات اللاحقة. يمكن أيضًا إضافة إنزيم الليزوزيم T4 NEBExpress® (NEB #P8115) وإنزيم النيوكلياز الميكروكوكي (NEB #M0247S) عند الحاجة.