نيو إنجلاند بيولابس، P8119S، تريبسين-ألترا™، درجة قياس الطيف الكتلي (مؤتلف)

تريبسين-ألترا، درجة قياس الطيف الكتلي (مؤتلف) هو بروتين سيرين بروتياز معاد تركيبه في الفئات ذات الصلة : البروتيازات، تطبيقات تحليل البروتينات، أدوات تحليل البروتينات، علم الأحياء السكرية وعلم البروتينات، مواصفات تحليل البروتينات السكرية. شروط التفاعل : محلول منظم من اختيارك، درجة الحموضة 7-9، نسبة التريبسين إلى الركيزة من 1:10 إلى 1:200، حضانة عند 37 درجة مئوية، الوزن الجزيئي الظاهري : 22.6 كيلو دالتون. الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين تريبسين-ألترا™، درجة قياس الطيف الكتلي (مؤتلف) (NEB #P8119)، وتريبسين-ألترا، درجة قياس الطيف الكتلي (NEB #P8101)؟ أ: تريبسين-ألترا، بدرجة نقاء مناسبة لتحليل الطيف الكتلي (مُعاد التركيب) (NEB #P8119) هو تريبسين خنزيري مُعاد التركيب، مُصنّع دون استخدام أي مكونات حيوانية. خضع هذا التربسين لعملية طفرات وتعديل كيميائي إضافي عبر المثيلة، مما جعله مقاومًا للغاية للتحلل الذاتي. في المقابل، يُعزل تريبسين-ألترا، بدرجة نقاء مناسبة لتحليل الطيف الكتلي (NEB #P8101)، ويُنقّى من بنكرياس الأبقار، ويُعالج بـ TPCK لتثبيط نشاط الكيموتريبسين المُصاحب له، ويُضاف إليه الأسيتيل لتقليل التحلل الذاتي. نظرًا لاستنساخه وتعبيره في بكتيريا الإشريكية القولونية، فإن تريبسين-ألترا، بدرجة نقاء مناسبة لتحليل الطيف الكتلي (مُعاد التركيب)، خالٍ طبيعيًا من الكيموتريبسين المُلوِّث، ويتمتع بمقاومة مُعززة للتحلل الذاتي. تُحسّن هذه الخصائص جودة الكروماتوغرام وبيانات تحليل الطيف الكتلي، مما يُؤدي إلى تحديد كمي دقيق للببتيدات والتعرف عليها. يُقدَّم تريبسين-ألترا، بدرجة نقاء مناسبة لتحليل الطيف الكتلي (مُعاد التركيب)، في صورة مجففة بالتجميد سهلة الاستخدام، ويظل مستقرًا لمدة 24 شهرًا. س: ما هي مزايا التريبسين المُعاد التركيب (NEB #P8119)؟ ج: تُعدّ نقاوة التريبسين وخلوه من أي نشاط بروتياز مُلوِّث أمرًا بالغ الأهمية لجودة بيانات تجارب رسم خرائط الببتيدات وتجارب البروتينات من الأسفل إلى الأعلى. يُستخلص التريبسين عادةً من مصادر حيوانية، مثل بنكرياس الخنزير. وغالبًا ما تُنقّى بروتيازات هضمية أخرى، مثل الكيموتريبسين، مع التريبسين. يتميز تريبسين-ألترا™، بدرجة نقاء مناسبة لتحليل الطيف الكتلي (مُعاد التركيب)، بخلوه التام من أي تلوث. علاوة على ذلك، ولأنه مُصمَّم هندسيًا للحد من التحلل الذاتي، فإن الببتيدات المُشتقة من التريبسين غائبة عن الأطياف. تُسهم نقاوة التربسين ومقاومته للتحلل الذاتي معًا في تحلل بروتيني نوعي، وتقليل تعقيد الأطياف، وزيادة دقة تحديد البروتينات وقياس كميتها، مما يُحسّن تحليل البيانات وإعداد التقارير في بيئة خاضعة للرقابة. س: لماذا تُعدّ مقاومة التحلل الذاتي مهمة؟ ما هي الخصائص التي تجعل تريبسين ألترا™، من الدرجة المستخدمة في قياس الطيف الكتلي (المُعاد تركيبه) (NEB #P8119) مقاومًا للتحلل الذاتي؟ ج: يُمكن أن يُؤدي التحلل الذاتي للتربسين إلى العديد من النتائج غير المرغوب فيها. أولًا، يُقلل التحلل الذاتي من نشاط التربسين، مما يُؤدي إلى هضم غير كامل وفقدان بعض مواقع التحلل. ثانيًا، يتميز ناتج التحلل الذاتي الوسيط، وهو ψ-تربسين، بانخفاض التخصصية، حيث يقوم بتحليل أحماض أمينية أخرى غير الليسين والأرجينين، مُظهرًا نشاطًا يُشبه نشاط الكيموتريبسين. ثالثًا، يُمكن أن يُصعّب التحلل الذاتي أيضًا عملية تقسيم التربسين وتخزينه والتعامل معه. تم تصميم التربسين المُعاد تركيبه هندسيًا للاحتفاظ بخصائصه الإنزيمية، كما تم إضافة مجموعة ميثيل إليه لجعله مقاومًا للتحلل الذاتي بشكل استثنائي. يؤدي ذلك إلى تحسين جودة البيانات، واستقرار الإنزيم، وسهولة التعامل. س: كيف أقوم بتقسيم وتخزين تريبسين ألترا™، المُستخدم في قياس الطيف الكتلي (المُعاد تركيبه) (NEB #P8119)؟ ج: للحصول على استقرار مثالي على المدى الطويل، يُعاد تكوين تريبسين ألترا، المُعاد تركيبه، المُستخدم في قياس الطيف الكتلي (المُعاد تركيبه) باستخدام ماء عالي النقاوة بتركيز يتراوح بين 0.1 و1 ميكروغرام/ميكرولتر، حسب الحاجة، ويُخزن المحلول الأصلي عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. يمكن الحفاظ على نشاط الإنزيم لخمس دورات من التجميد والذوبان. س: ما هو محلول التفاعل الذي يمكن استخدامه لهضم التربسين؟ ج: يتوافق التربسين مع أنواع عديدة من محاليل التفاعل، مع درجة حموضة مثالية تتراوح بين 8 و9. من محاليل التفاعل الشائعة: 50 ملي مولار من Tris-HCl، درجة حموضة 8.0، أو 50 ملي مولار من بيكربونات الأمونيوم، درجة حموضة 7.8. على الرغم من أن أيونات الكالسيوم ليست ضرورية لنشاط التربسين، إلا أنها تُساهم في استقراره، خاصةً في ظروف الهضم المطوّلة. ويُستخدم عادةً تركيز يتراوح بين 1 و10 ملي مولار. كما يعتمد اختيار محلول الهضم على طريقة جمع عينة البروتين أو تحضيرها، وما إذا كان الهضم سيتبعه مباشرةً تحليل مطياف الكتلة. وبشكل عام، يُعتبر محلول بيكربونات الأمونيوم هو الأنسب لتحليل مطياف الكتلة، نظرًا لتطاير كل من الأنيونات والكاتيونات. س: ما هي النسبة المثلى للتربسين إلى البروتين في عملية الهضم؟ ج: تتراوح نسبة التربسين إلى البروتين عادةً بين 1:20 و1:100، مع التوصية الشائعة بنسبة 1:50، مما يُؤدي إلى هضم فعّال دون تحلل ذاتي مفرط للتربسين. وتعتمد هذه النسبة غالبًا على عوامل مثل طبيعة عينة البروتين ومصدرها، واستخدام محلول مناسب، ودرجة حرارة الحضانة. عند استخدام تريبسين ألترا™، من نوع مطياف الكتلة (مُعاد التركيب) (NEB #P8119) في عمليات التحليل السريعة أو عالية الإنتاجية، استخدمنا نسبًا مقدارها 1:5 أو 1:10 (دون ظهور أي شوائب ملحوظة)، مما مكّن من إتمام عملية الهضم في غضون 30 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. س: هل يتوافق التربسين مع المنظفات؟ ج: غالبًا ما تُستخدم المنظفات والتركيزات العالية من العوامل الفوضوية، مثل كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) واليوريا وهيدروكلوريد الغوانيدين، لتفكيك بنية عينات البروتين قبل معالجتها بالبروتياز. مع ذلك، فإن التركيزات العالية من العوامل الفوضوية والمنظفات الأيونية (مثل كبريتات دوديسيل الصوديوم بتركيز يزيد عن 0.1%) تُثبّط عمل التربسين. لذا، يجب استبدال محلول العينات المُفككة أو غسلها بالترشيح الغشائي في محلول مناسب لتفاعل التربسين قبل إضافة التربسين للهضم. بعض المنظفات غير الأيونية، مثل NP-40 وتريتون، قد تكون متوافقة مع هضم التربسين بتركيزات منخفضة، ولكن يجب إزالتها من العينة قبل تحليل مطياف الكتلة. س: ما هي درجة الحرارة المثلى لإجراء هضم التربسين؟ ج: يُجرى هضم التربسين عادةً عند 37 درجة مئوية، ولكن يمكن حضانة تفاعلات التربسين عند درجات حرارة مرتفعة (من 50 إلى 70 درجة مئوية) لتسريع عملية التحلل البروتيني. في هذه الحالة، يجب مراعاة الثبات الحراري لعينة البروتين وتعديلاتها اللاحقة للترجمة (مثل زيادة معدل نزع الأميد من الأسباراجين). س: كيف يمكنني إزالة الأملاح من الببتيدات بعد هضم التربسين؟ ج: بعد هضم التربسين وقبل تحليل مطياف الكتلة، يمكن تنظيف عينات الببتيدات لإزالة الملوثات التي تتداخل مع مطياف الكتلة. يمكن تحقيق ذلك باستخدام أعمدة الاستبعاد الحجمي، أو أعمدة الاستخلاص الطوري الصلب (SPE)، أو الخراطيش. س: هل يمكن استخدام بروتيازات أخرى مع التربسين؟ أ: تُستخدم عمليات الهضم باستخدام إنزيمين بروتينيين، سواءً بالتتابع أو بالتزامن، أحيانًا لتعزيز القطع الموضعي أو لتحقيق أقصى تغطية لتسلسلات البروتين. يمكن أن يكون الإنزيم البروتيني الآخر مكملاً (مثل إنزيم Endoproteinase GluC، NEB #P8100، أو إنزيم α-Lytic Protease، NEB #P8113) أو إضافيًا (مثل إنزيم Endoproteinase LysC، NEB #P8109).