مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R0105S، HpaI

تمت إعادة صياغة إنزيم HpaI باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10128074. الفئات ذات الصلة: إنزيمات القطع المحددة، تطبيقات HM، مواصفات هضم إنزيم القطع، تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffers : NEBuffer™ r1.1: <10%، NEBuffer™ r2.1: 75%، NEBuffer™ r3.1: 25%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف A، محلول التخزين : 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 50 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. تعطيل بالحرارة عند 25 درجة مئوية. لا حساسية للمثيلة. مثيلة dam: غير حساسة. مثيلة dcm: غير حساسة. مثيلة CpG: يتم حجبها بواسطة بعض تركيبات التداخل. الأسئلة الشائعة: س: متى يُشكل النشاط النجمي مشكلة لإنزيم HpaI؟ ج: قد تؤدي ظروف التركيز العالي للإنزيم، أو تركيز الجلسرين الذي يزيد عن 5%، أو الرقم الهيدروجيني الذي يزيد عن 8.0 إلى نشاط نجمي. س: ما الذي نعرفه عن النشاط النجمي لإنزيم HpaI؟ ج: يمكن الكشف عن النشاط النجمي لإنزيم HpaI باستخدام 10 وحدات من الإنزيم على ميكروغرام واحد من الحمض النووي لامدا بعد 16 ساعة. س: كيف توصون باستخدام إنزيم HpaI؟ ج: لا تخففه إلى أقل من تركيز البيع. س: هل يثبط ملح معين أو مستوى معين من الملح نشاط إنزيم HpaI؟ ج: تشير بعض البيانات إلى أن تركيزات الملح التي تزيد عن 10 ملي مولار قد تثبط نشاط إنزيم HpaI. (كروتي، س.، ملاحظة غير منشورة) لذلك، قد يكون الحمض النووي المُحضّر بتقنية الميني بريبير والمحتوي على بقايا ملح مقاومًا لإنزيم HpaI. يُنصح بغسله بمحلول إيثانول 70% أو إجراء عملية غسيل كلوي لإزالة الملح. عند إجراء ترسيب الإيثانول، يُنصح باستخدام أسيتات البوتاسيوم، عند الضرورة، بدلًا من أسيتات الأمونيوم أو أسيتات الصوديوم، نظرًا لاحتمالية تثبيط نشاط إنزيم HpaI. س: هل يزيد السبيرميدين من نشاط إنزيم HpaI؟ ج: يُثبّط السبيرميدين نشاط إنزيم HpaI بتركيزات تتراوح بين 0.5 و2.0 ملي مولار. (مرجع REBASE رقم 1288. كوسمانين، م.، بوسو، هـ. رسائل FEBS 179: 17-20 (1985). س: هل يُثبَّط إنزيم HpaI بواسطة dUTP المُدمج في الموقع؟ ج: نعم. مرجع REBASE رقم 551. دوير، ب.أ.، ريفتينا، ف.، أغاروال، ك.ل. وقائع الاتحاد 38: 294 (1979). س: هل إنزيم HpaI نشط عند 25 درجة مئوية؟ ج: يتمتع إنزيم HpaI بنشاط يتراوح بين 50 و75% عند 25 درجة مئوية. س: ما هو الوزن الجزيئي لإنزيم HpaI؟ ج: 30 كيلو دالتون كما تم تحديده من بيانات التسلسل. س: اختبرت إنزيم التقييد الخاص بكم على ركيزة الحمض النووي الموصى بها من قِبل NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي يمكن أن تؤثر على نشاط الإنزيم. التقييد قد تُثبَّط الإنزيمات النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات التركيز الملحي العالي)، بفعل الملح في التفاعل. قد تُنتج إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الملح، والتي قد تنتقل إلى التفاعل وتُثبِّط نشاط الإنزيم. ولمنع ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المُضاف إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. ويمكن تحقيق ذلك بتعديل إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: ما هو النشاط النجمي وكيف يمكن تجنبه؟ ج: لقد ثبت أنه في ظل ظروف غير قياسية قاسية، تكون إنزيمات القطع قادرة على قطع تسلسلات مشابهة لتسلسل التعرف المحدد لها، ولكنها ليست مطابقة له. وقد أُطلق على هذه الخصوصية المتغيرة أو المُخففة اسم "النشاط النجمي". وقد اقتُرح أن النشاط النجمي قد يكون خاصية عامة لإنزيمات القطع، وأنه يمكن جعل أي إنزيم قطع يقطع تسلسلات غير نمطية. في ظل ظروف قاسية معينة، تتغير خصوصية الإنزيم باختلاف الإنزيم والظروف المستخدمة لتحفيز نشاطه النجمي. تشمل أكثر أنواع النشاط المتغير شيوعًا استبدال قاعدة واحدة، وقص القواعد الخارجية في تسلسل التعرف، وقطع سلسلة مفردة. يمكن التحكم في النشاط النجمي بشكل كامل في الغالبية العظمى من الحالات، ولا يُعدّ مصدر قلق عند إجراء عمليات هضم باستخدام إنزيمات القطع. لن تُظهر إنزيمات شركة نيو إنجلاند بيولابس نشاطًا نجميًا عند استخدامها في ظل الظروف الموصى بها في محاليل NEBuffers المرفقة. فيما يلي ظروف التفاعل المعروفة بتحفيز أو تثبيط النشاط النجمي. الظروف التي تُسهم في النشاط النجمي: 1. تركيز عالٍ من الجلسرين [> 5% حجم/حجم] 2. نسبة عالية من الوحدات إلى ميكروغرام من الحمض النووي [تختلف باختلاف كل إنزيم، وعادةً ما تكون > 100 وحدة/ميكروغرام] 3. قوة أيونية منخفضة [< 25 ملي مولار] 4. درجة حموضة عالية [> 8.0] 5. وجود مواد عضوية المذيبات [DMSO، إيثانول، إيثيلين جليكول، ثنائي ميثيل أسيتاميد، ثنائي ميثيل فورماميد، سلفالان] 6. استبدال Mg++ بأيونات ثنائية التكافؤ أخرى [Mn++، Cu++، Co++، Zn++] تثبيط النشاط النجمي إذا كنت قلقًا بشأن النشاط النجمي، فنوصي باتباع الإرشادات التالية. 1. استخدم أقل عدد ممكن من الوحدات للحصول على هضم كامل. هذا يتجنب الهضم الزائد ويقلل من تركيز الجلسرين النهائي في التفاعل. 2. تأكد من خلو التفاعل من أي مذيبات عضوية مثل الكحولات التي قد تكون موجودة في تحضير الحمض النووي. 3. ارفع القوة الأيونية لمحلول التفاعل إلى 100-150 ملي مولار (شريطة ألا يتم تثبيط الإنزيم بواسطة تركيز عالٍ من الملح). 4. اخفض الرقم الهيدروجيني لمحلول التفاعل إلى 7.0. 5. استخدم Mg++ كأيون ثنائي التكافؤ. س: كيف يمكن تعطيل هذا الإنزيم؟ ج: لتعطيل الإنزيمات التي لا تستطيع في حال عدم إمكانية قتل الحمض النووي بالحرارة، نوصي باستخلاص الفينول متبوعًا بالترسيب بالإيثانول أو استخدام عمود طرد مركزي تجاري مصمم لتنقية الحمض النووي. س: ما هي إنزيمات التقييد من NEB التي تأتي مع صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X)؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF ومعظم إنزيمات التقييد غير HF من NEB تأتي مع صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X). إنزيمات التقييد غير HF التي تأتي مع صبغة بنفسجية هي: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * جميع إنزيمات التقييد HF مزودة أيضًا بصبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X) س: هل هذا الإنزيم حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: نعم. لا يستطيع هذا الإنزيم قطع مواقع التعرف في الحمض النووي الجينومي للثدييات التي يتم حظرها بواسطة بعض تركيبات مثيلة CpG المتداخلة. للحصول على معلومات محدثة حول حساسية المثيلة، يرجى زيارة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من BSA إلى الألبومين المؤتلف (rAlbumin) في NEBuffers؟ ج: يسعد NEB أن تعلن عن تغيير محاليل التفاعل المحتوية على BSA (NEBuffer 1.1، نُجري حاليًا تعديلات على محاليلنا المُصنّعة من 2.1 و3.1 وCutSmart® Buffer إلى محاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1 وr2.1 وr3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونعتقد أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونُقدم هذا التحسين بنفس السعر. س: هل يُمكن تخزين صبغة تحميل الجل، البنفسجي 6X (B7024) في درجات حرارة منخفضة؟ ج: درجة حرارة التخزين المُوصى بها لصبغة تحميل الجل، البنفسجي 6X، هي درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). عادةً، قد يترسب SDS من المحلول عند تخزين الصبغة في درجات حرارة منخفضة. يُمكن التخلص من هذا الترسب الطفيف بترك القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة، أو تسخينها برفق لمدة 10 دقائق. يُرجى رج القارورة عدة مرات قبل الاستخدام لإعادة المحلول إلى درجة حرارة الغرفة. التجانس.