مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R0109S، FokI

تمت إعادة صياغة FokI، وهي تشمل الآن أيضًا الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10295609. الفئات ذات الصلة: إنزيمات القطع المحددة، تطبيقات CG، مواصفات هضم إنزيمات القطع، تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 100%، NEBuffer™ r2.1: 100%، NEBuffer™ r3.1: 75%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف أ: محلول التخزين ، 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار داي ثيو ثريتول، 0.1 ملي مولار إيديتات ثنائي الصوديوم، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. تعطيل بالحرارة عند 25 درجة مئوية، ثم عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: تتأثر بتداخل مواقع CpG، مثيلة: تتأثر بتداخل مواقع CpG. الأسئلة الشائعة : س: هل يميل إنزيم FokI إلى تحطيم الحمض النووي؟ ج: نعم. استخدم بحد أقصى 2-3 وحدات/ميكروغرام من الحمض النووي، لمدة ساعة واحدة أو أقل. يمكن إضافة Tween 20 بتركيز نهائي 0.1% لتقليل التحطيم. س: لماذا يُحطّم إنزيم FokI الحمض النووي؟ ج: يحتوي إنزيم FokI على نطاقين؛ أحدهما يتعرف على الحمض النووي والآخر يقوم بقطعه. البروتين غير مستقر، ومع فقدان النشاط النوعي، يزداد النشاط غير النوعي. يعمل Tween 20 على تثبيت البروتين وإبطاء زيادة النشاط غير النوعي. س: هل يُنصح بالهضم المطول لإنزيم FokI؟ ج: الهضم المطول غير مفيد لأن الإنزيم غير مستقر في التفاعل ويمكن أن يُحطّم الحمض النووي. س: هل يُعيق المثيلة عمل إنزيم FokI؟ ج: يقطع إنزيم FokI الحمض النووي ببطء يتراوح بين ضعفين إلى أربعة أضعاف إذا تبعت قاعدة السيتوزين (C) في نهاية التسلسل قاعدة غوانين (G) وكانت مثيلة. كما لا يقطع إنزيم FokI الحمض النووي بشكل كامل إذا وُجد موقع مثيلة لإنزيم MspI قبل موقع التعرف. لمزيد من المعلومات حول حساسية المثيلة، يُرجى زيارة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل يُستخدم إنزيم FokI في تقنيات خاصة؟ ج: يُستخدم إنزيم FokI للقطع بين أي زوجين من القواعد. انظر Podhajska, AJ, Szybalski, W. (1985). Gene 40: 175-182. باختصار، يتم تصنيع قليل النوكليوتيدات الذي يحتوي على موقع FokI مزدوج السلسلة وامتداد أحادي السلسلة يرتبط بقالب الحمض النووي عند النقطة المراد قطعها. ثم يتم ربط قليل النوكليوتيدات المزدوج بقالب الحمض النووي أحادي السلسلة. في تفاعل الانشطار اللاحق، سيرتبط إنزيم FokI بموقع السلسلة المزدوجة على جزيء الأوليغونوكليوتيد المزدوج، وسيقطع القالب الذي يرتبط به. س: ما هو الوزن الجزيئي لإنزيم FokI؟ ج: 65.6 كيلو دالتون، كما تم تحديده من بيانات التسلسل. س: هل نشاط إنزيم FokI حساس لدرجة الحموضة؟ ج: يتراوح نطاق درجة الحموضة الأمثل لإنزيم FokI بين 7.0 و8.5. س: هل إنزيم FokI نشط عند درجة حرارة 25 درجة مئوية؟ ج: يُظهر إنزيم FokI نشاطًا بنسبة 25-50% عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. س: هل يقوم إنزيم FokI بقطع الحمض النووي أحادي السلسلة؟ ج: لا. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من الألبومين البقري المصل (BSA) إلى الألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونرى أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر.