مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R0114S، ApaI

درجة حرارة حضانة جديدة 37 درجة مئوية. الفئات ذات الصلة : إنزيمات القطع المحددة: أ، تطبيقات إنزيمات القطع المحددة الموفرة للوقت: الاستنساخ السريع: سرّع عمليات الاستنساخ باستخدام كواشف من NEB، مواصفات هضم إنزيم القطع، تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من حمض pXba النووي في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 25%، NEBuffer™ r2.1: 25%، NEBuffer™ r3.1: <10%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف أ: محلول التخزين ، 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 50 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 1 ملي مولار داي ثيو ثريتول، 0.1 ملي مولار إيديتات ثنائي الصوديوم، 500 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. تعطيل بالحرارة عند 25 درجة مئوية، ثم عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: محجوبة بتداخل مثيلة CpG، النشاط عند درجة حرارة 25 درجة مئوية: 100%. الأسئلة الشائعة : س: هل نشاط ApaI حساس لمثيلة dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: نعم. لا يستطيع ApaI قطع مواقع التعرف التي تحتوي على مثيلة dcm متداخلة. كما لا يستطيع قطع مواقع التعرف في الحمض النووي الجينومي للثدييات التي تحتوي على مثيلة CpG متداخلة. لمزيد من المعلومات حول حساسية المثيلة، يرجى زيارة REBASE. س: كم عدد أزواج القواعد التي يجب إضافتها في نهاية بادئ PCR بعد موقع تعرف ApaI لضمان قطع ApaI بشكل صحيح؟ ج: يوصى بإضافة 6 أزواج من القواعد. س: هل يحتوي ApaI على أي انقسامات جديدة؟ ج: نعم. إنزيم Bsp120I وPspOMI هما إنزيمان من نوع neoschizimomer لإنزيم ApaI، لكن ApaI هو الإنزيم الوحيد الذي يُنتج امتدادًا في الطرف 3'. للحصول على أحدث المعلومات حول إنزيمات isoschizomers/neoschizomers، يُرجى الرجوع إلى REBASE. س: يبدو أن إنزيم ApaI يواجه بعض الصعوبات في قطع الحمض النووي الخاص بي. ما السبب في ذلك؟ ج: يتم تثبيط نشاط إنزيم ApaI بتركيزات ملحية أعلى من 50 ملي مولار. إذا نتج عن عزل الحمض النووي محلول حمض نووي ذو مستويات عالية من الملح، فقد يواجه الإنزيم صعوبة في قطع هذا الحمض النووي. س: هل يجب عليّ إعداد عمليات الهضم باستخدام إنزيمات Time-Saver™ المعتمدة لمدة 5-15 دقيقة؟ هل يمكنني إجراء عملية الهضم لفترة أطول؟ ج: تتميز إنزيمات Time-Saver™ من NEB بسرعة عملها (5-15 دقيقة)، كما أنها مصممة ومؤهلة لتحمل عمليات الهضم طوال الليل دون إتلاف الحمض النووي. س: اختبرت إنزيم التقييد الخاص بكم على الحمض النووي الركيزة الموصى به من NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي تؤثر على نشاط الإنزيم. قد تُثبط الأملاح الموجودة في التفاعل إنزيمات القطع النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات التركيز الملحي العالي). قد تُؤدي إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي إلى محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الأملاح، والتي قد تنتقل إلى التفاعل وتُثبط نشاط الإنزيم. لتجنب ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المُضاف إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. يُمكن تحقيق ذلك بتعديل إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: ما هي إنزيمات القطع من NEB المُرفقة بصبغة تحميل الجل البنفسجية (6X)؟ ج: جميع إنزيمات القطع HF ومعظم إنزيمات القطع غير HF من NEB مُرفقة بصبغة تحميل الجل البنفسجية (6X). الإنزيمات المقيدة غير HF التي تأتي مع الصبغة الأرجوانية هي: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI Sali XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * يتم أيضًا توفير جميع إنزيمات تقييد HF مع تحميل الجل الصبغ، الأرجواني (6X) س: هل يمكنك معرفة ذلك هل يمكنك إخباري بالمزيد عن التحول من الألبومين البقري المصل (BSA) إلى الألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري المصل (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1، وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1، وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونعتقد أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر. س: في محاولة لتوحيد ظروف التفاعل، تم تغيير درجة حرارة التحضين الموصى بها لكل من ApaI (NEB #R0114) وBaeI (NEB #R0613) وBsrDI (NEB #R0574) وSmaI (NEB #R0141). ما هي درجة حرارة التحضين التي يجب استخدامها؟ ج: يمكنك التحضين بأمان عند أي من درجتي الحرارة. يُرجى ملاحظة أنه بالنسبة لـ SmaI، نقترح التحضين عند 25 درجة مئوية في حال إجراء عمليات هضم مطولة (أكثر من ساعة). س: هل تكون بعض إنزيمات التقييد أكثر نشاطًا عند درجات حرارة تحضين أعلى من الموصى بها؟ ج: إنزيمات التقييد من NEB نشطة بنسبة 100% عند درجة حرارة التحضين الموصى بها في المحلول المنظم الموصى به والمرفق مع كل إنزيم. مع بعض إنزيمات التقييد المعزولة من الكائنات المحبة للحرارة، قد تلاحظ زيادة في النشاط عند درجات حرارة تحضين أعلى. لا نوصي بزيادة درجة الحرارة حيث قد تظهر أنشطة نوكلياز إضافية عند درجات حرارة غير موصى بها.