مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R0123S، SfiI

يتطلب موقعين أو أكثر للقطع. يرجى مراجعة قائمة الإنزيمات والتوصيات في الفئات ذات الصلة التالية: إنزيمات القطع المحددة، إنزيمات القطع المحددة الموفرة للوقت، التطبيقات، مواصفات هضم إنزيم القطع، تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من حمض pXba النووي في ساعة واحدة عند 50 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 50 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 25%، NEBuffer™ r2.1: 100%، NEBuffer™ r3.1: 50%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : محلول التخزين المخفف C: 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 250 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي مولار EDTA، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مصل البقر، 50% جلسرين، 0.15% تريتون® X-100، 1 ملي مولار DTT عند درجة حموضة 7.4 ودرجة حرارة 25 درجة مئوية: تعطيل حراري، لا حساسية للمثيلة، مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: تتأثر بتداخل مواقع CpG، مثيلة CpG: تُحجب ببعض تركيبات التداخل، النشاط عند درجة حرارة 37 درجة مئوية: 10%. الأسئلة الشائعة : س: ما هي أقل مسافة مطلوبة بين موقعي SfiI؟ هل يمكنهما أن يتبعا بعضهما البعض مباشرة؟ ج: يمكن الإجابة على هذا السؤال على عدة مستويات. إذا كنت ترغب فقط في تحقيق كفاءة هضم جيدة مثل تلك الموجودة في ناقل يحتوي على موقع SfiI واحد (وهو هضم غير فعال)، فيمكنك استخدام فصل يبلغ حوالي 10 أزواج قاعدية. لتحقيق الكفاءة المثلى في قطع موقعي SfiI، ستحتاج إلى تضمين "قطعة حشو" لا تقل عن 170 زوجًا قاعديًا. [أقترح 200 زوجًا قاعديًا]. يبدو أن حركية SfiI فريدة من نوعها بين إنزيمات التقييد المتوفرة تجاريًا. لهذا السبب، قد يكون تحسين تفاعلات SfiI صعبًا. يُعدّ الناقل الذي يحتوي على موقع SfiI واحد على الأرجح أصعب أنواع مواقع SfiI إذا كان الهدف هو تحقيق اكتمال تام. كل من نسبة الإنزيم إلى الحمض النووي (الوحدات: ميكروغرام) وتركيز الحمض النووي مهمان. يُقطع الناقل الذي يحتوي على موقعي SfiI بسرعة أكبر بكثير، نظرًا لتفاعل تعاوني يشمل كلا الموقعين، ولكن فقط إذا كان الموقعان مفصولين بمسافة 170 زوجًا قاعديًا على الأقل (وهي مسافة كافية للسماح بتكوين حلقة في الحمض النووي). س: هل يمكنني تحقيق هضم بلازميد يحتوي على موقع SfiI واحد؟ ج: تُساعد زيادة تركيز الحمض النووي في تفاعلات النقل (لذا يمكنك تحقيق الهضم بزيادة تركيز الحمض النووي، ولكن قد لا يكون ذلك فعالًا)، ولكن على عكس المتوقع، يمكن إعاقة تفاعل SfiI بزيادة تركيز الإنزيم. في التفاعلات التي يكون فيها الإنزيم أكثر من مواقع الحمض النووي، يُحمّل كل موقع برباعي SfiI، مما يمنع البروتين من الارتباط بالموقعين اللازمين للنشاط الكامل. س: هل يجب أن تكون مواقع التعرف المتغيرة متناظرة؟ ج: معظم مواقع التعرف لإنزيمات التقييد متناظرة وتتضمن أزواج قواعد محددة فقط (مثلًا، EcoRI يتعرف على GAATTC). مع ذلك، تحتوي بعض الإنزيمات على مواقع متغيرة، أي أنها تحتوي على زوج قاعدة واحد أو أكثر غير محدد (مثلًا، BsrFI-v2 يتعرف على RCCGGY، حيث R = A أو G و Y = C أو T). بالنسبة للإنزيمات المتغيرة، يمكن أن توجد أي قاعدة ممثلة بالرمز المكون من حرف واحد في أي من موقعي التعرف لحدوث القطع. على سبيل المثال، يتعرف BsrFI-v2 على جميع التسلسلات التالية: ACCGGC، ACCGGT، GCCGGC، GCCGGT. س: كيف يمكن تعطيل هذا الإنزيم؟ ج: لتعطيل الإنزيمات التي لا يمكن قتلها بالحرارة، نوصي باستخلاص الفينول متبوعًا بالترسيب بالإيثانول أو استخدام عمود طرد مركزي تجاري مصمم لتنقية الحمض النووي. س: لماذا لا يقطع الإنزيم بشكل كامل؟ ج: تُقطع الركائز التي تحتوي على موقع SfiI واحد بكفاءة أقل من الركائز التي تحتوي على موقعين. "يوجد SfiI في المحلول على شكل رباعي، ويبدو أنه يتفاعل مع نسختين من تسلسل التعرف الخاص به قبل أن يتمكن من قطع الحمض النووي. يتمثل تفاعله الأساسي بعد ذلك في قطع كلا الشريطين عند كلا الموقعين في عملية متناسقة. يمكن أن يكون الموقعان على نفس جزيء الحمض النووي أو على جزيئين مختلفين." - من لويس م. وينتزل، وتيموثي ج. نوبس، وستيفن إي. هالفورد، مجلة البيولوجيا الجزيئية 248: 581-595 (1995). "يقوم إنزيم SfiI المقيد بقطع الحمض النووي رباعي السلاسل عند نسختين من تسلسل التعرف الخاص به." س: هل يمكنني إضافة قليل النوكليوتيدات إلى تفاعلي بحيث يتوفر موقعان للقطع بكفاءة؟ ج: نعم. طالما أن هناك موقعين متاحين، سواء كانا على نفس جزيء الحمض النووي أو على جزيئين مختلفين، فلا يهم. س: هل يجب عليّ تحضير عملية الهضم باستخدام إنزيمات Time-Saver™ المعتمدة لمدة 5-15 دقيقة؟ هل يمكنني الهضم لفترة أطول؟ ج: تتميز إنزيمات Time-Saver™ من NEB بسرعة عملها (5-15 دقيقة)، كما أنها مصممة ومؤهلة لتحمل الهضم طوال الليل دون إتلاف الحمض النووي. س: اختبرت إنزيم التقييد الخاص بكم على الحمض النووي الركيزة الموصى به من NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي تؤثر على نشاط الإنزيم. قد تُثبط الأملاح الموجودة في التفاعل إنزيمات التقييد النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات الملوحة العالية). قد تؤدي إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي إلى محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الأملاح التي قد تنتقل إلى التفاعل وتثبط نشاط الإنزيم. لتجنب ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المضاف إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. ويمكن تحقيق ذلك بتعديل إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: ما هي إنزيمات التقييد من NEB التي تأتي مزودة بصبغة تحميل الجل البنفسجية (6X)؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF ومعظم إنزيمات التقييد غير HF من NEB تأتي مزودة بصبغة تحميل الجل البنفسجية (6X). الإنزيمات المقيدة غير HF التي تأتي مع الصبغة الأرجوانية هي: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI Sali XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * يتم أيضًا توفير جميع إنزيمات تقييد HF مع تحميل الجل صبغ، بنفسجي (6X) س: هل هذا هل الإنزيم حساس لـ Dam أو DCM أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: نعم. لا يستطيع هذا الإنزيم قطع مواقع التعرف التي تتأثر بمثيلة DCM المتداخلة أو التي تُحجب ببعض تركيبات مثيلة CpG المتداخلة. للحصول على أحدث المعلومات حول حساسية المثيلة، يُرجى زيارة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من BSA إلى الألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على BSA (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المؤتلف (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل rAlbumin. نشعر أن الابتعاد عن المنتجات التي تحتوي على مكونات حيوانية هو خطوة في الاتجاه الصحيح، ونحن قادرون على تقديم هذا التحسين بنفس السعر.