مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R0163L، MnlI

تمت إعادة صياغة MnlI باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10161943. الفئات ذات الصلة: إنزيمات القطع المحددة HM، إنزيمات قطع محددة موفرة للوقت. التطبيقات: الاستنساخ السريع: سرّع عمليات الاستنساخ باستخدام كواشف من NEB. مواصفات هضم إنزيم القطع : تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 75%، NEBuffer™ r2.1: 100%، NEBuffer™ r3.1: 50%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف B، محلول التخزين : 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 300 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 500 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. تعطيل الإنزيم بالحرارة عند 25 درجة مئوية، ثم عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: غير حساسة. الأسئلة الشائعة : س: كيف توصون باستخدام MnlI؟ ج: 1. يعمل MnlI بشكل أفضل على الحمض النووي المغسول أو المعالج بالديال. 2. لا تقم بالهضم لأكثر من 4 ساعات. 3. في حالة عدم اكتمال القطع، استخدم المزيد من الإنزيم. س: هل يوجد تباين في موقع القطع لـ MnlI؟ ج: يبدو أن هناك تأثيرًا متذبذبًا يحاكي نشاط النجمة، ويمثل موقع قطع متغير. يترك MnlI دائمًا نتوءًا أحادي القاعدة 3'. ستقطع غالبية المواقع، وفقًا لشروط تعريف الوحدة لدينا، عند (7/6) من موقع التعرف، ولكن تم الإبلاغ عن أن بعض المواقع تقطع عند (7/8) من موقع التعرف. س: هل تم تعديل موقع التعرف أو موقع القطع لإنزيم MnlI؟ ج: نعم، تم تعديل موقع القطع لإنزيم MnlI. (Brinkly, P., Bausista, DS, and Graham, FL (1991) Gene: 100. 267-268). س: هل يقوم إنزيم MnlI بقطع الحمض النووي فائق الالتفاف؟ ج: يلزم ضعف كمية إنزيم MnlI لهضم الحمض النووي puc19. س: ما هو نشاط إنزيم MnlI عند درجة حرارة 25 درجة مئوية؟ ج: تتراوح نسبة نشاطه بين 25% و50%. س: هل يقوم إنزيم MnlI بقطع الحمض النووي أحادي السلسلة؟ ج: يقوم إنزيم MnlI بقطع الحمض النووي أحادي السلسلة ببطء لا يقل عن 50%. س: هل يجب عليّ تحضير عمليات الهضم باستخدام إنزيمات Time-Saver™ لمدة تتراوح بين 5 و15 دقيقة؟ هل يمكنني إجراء عملية الهضم لفترة أطول؟ ج: تتميز إنزيمات Time-Saver™ من NEB بسرعة عملها (من 5 إلى 15 دقيقة)، كما أنها مصممة ومؤهلة لتحمل عمليات الهضم طوال الليل دون إتلاف الحمض النووي. س: اختبرتُ إنزيم القطع الخاص بكم على الحمض النووي الموصى به من NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي تؤثر على نشاط الإنزيم. قد تُثبط الأملاح الموجودة في التفاعل إنزيمات القطع النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات التركيز الملحي العالي). قد تُثبط الأملاح الموجودة في التفاعل نشاط إنزيمات القطع النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات التركيز الملحي العالي). قد تؤدي إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي إلى محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الأملاح التي قد تنتقل إلى التفاعل وتُثبط نشاط الإنزيم. لتجنب ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المُضاف إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق ضبط إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: هل هذا الإنزيم حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: لا. هذا الإنزيم غير حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات. للحصول على معلومات محدثة حول حساسية المثيلة، يُرجى زيارة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من BSA إلى الألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على BSA (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المؤتلف (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل rAlbumin. نشعر أن الابتعاد عن المنتجات التي تحتوي على مكونات حيوانية هو خطوة في الاتجاه الصحيح، ونحن قادرون على تقديم هذا التحسين بنفس السعر.