مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R0171M، HpaII

تمت إعادة صياغة إنزيم HpaII باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10232250. الفئات ذات الصلة: الكشف عن الهيدروكسي ميثيل وتحليله، إنزيمات التقييد الحساسة للمثيلة والمعتمدة على المثيلة لعلم التخلق، إنزيمات التقييد لتحليل علم التخلق، التطبيقات : الاستنساخ السريع: تسريع عمليات الاستنساخ باستخدام كواشف من NEB، مواصفات هضم إنزيم التقييد : تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 100%، NEBuffer™ r2.1: 50%، NEBuffer™ r3.1: <10%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف أ: محلول التخزين ، 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار داي ثيو ثريتول، 0.1 ملي مولار إيدتا، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. تعطيل حراري عند 25 درجة مئوية، ثم عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: محظورة. الأسئلة الشائعة: س: هل يُثبط HpaII بالملح؟ ج: يُثبط HpaII بتركيزات ملحية تزيد عن 50 ملي مولار من كلوريد البوتاسيوم. س: هل يتأثر HpaII بالمثيلة؟ ج: لن يقطع HpaII المواقع إذا كانت السيتوزين الثاني في تسلسل التعرف CCGG مثيلة بواسطة ناقلة ميثيل SssI أو ناقلة ميثيل HpaII. عندما تكون السيتوزين الأول في المواقع مثيلة بواسطة ناقلة ميثيل MspI، سيقطع الإنزيم أبطأ بمقدار 300 مرة من الحمض النووي غير المثيل، وأبطأ بمقدار 50 مرة إذا كان الحمض النووي نصف مثيل. (McClelland, M., Nelson, M., Raschke, E. (1994)). مجلة أبحاث الأحماض النووية، المجلد 22، العدد 17، الصفحات 3640-3659. س: ما هو الوزن الجزيئي لإنزيم HpaII؟ ج: الوزن الجزيئي 40 كيلو دالتون، كما تم تقديره بواسطة تقنية PAGE. س: هل يزيد السبيرميدين من نشاط إنزيم HpaII؟ ج: لا حاجة إليه إلا في حال وجود موقع واحد فقط لإنزيم HpaII. س: هل يقوم إنزيم HpaII بقطع الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA)؟ ج: لا. س: ما هو نشاط إنزيم HpaII عند درجة حرارة 25 درجة مئوية؟ ج: تتراوح نسبة نشاط إنزيم HpaII بين 50% و75% عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. س: هل يجب عليّ تحضير عمليات الهضم باستخدام إنزيمات Time-Saver™ المعتمدة لمدة تتراوح بين 5 و15 دقيقة؟ هل يمكنني إجراء عملية الهضم لفترة أطول؟ ج: تتميز إنزيمات Time-Saver™ من NEB بسرعة عملها (5-15 دقيقة)، كما أنها مصممة ومعتمدة لتحمل عمليات الهضم التي تتم طوال الليل دون إتلاف الحمض النووي. س: اختبرتُ إنزيم القطع الخاص بكم على الحمض النووي الموصى به من قِبل شركة NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي تؤثر على نشاط الإنزيم. قد تُثبَّط إنزيمات القطع النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات التركيز الملحي العالي)، بسبب وجود الملح في التفاعل. قد تُؤدي إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي إلى محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الملح، والتي قد تنتقل إلى التفاعل وتُثبِّط نشاط الإنزيم. لتجنب ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المُضافة إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. يُمكن تحقيق ذلك عن طريق تعديل إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: هل توجد مواقع بطيئة لإنزيم HpaII في النواقل الشائعة؟ ج: يوجد "موقع بطيء" في فيروس SV40. يحتوي هذا الحمض النووي على موقع قطع واحد فقط. قد يعود بطء النشاط إلى حاجة الإنزيم إلى موقعين للقطع بكفاءة. (أولر، آر. إيه.، بروك، في. دبليو.، كونراد، إم.، توبال، إم. دي. (1991) الكيمياء الحيوية 30، ص 2543-2549). س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من الألبومين البقري المصل (BSA) إلى الألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري المصل (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المؤتلف (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المؤتلف. نشعر أن الابتعاد عن المنتجات التي تحتوي على مكونات حيوانية هو خطوة في الاتجاه الصحيح، ونحن قادرون على تقديم هذا التحسين بنفس السعر.