مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R0182L، SphI

تمت إعادة صياغة SphI باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10172120. الفئات ذات الصلة: إنزيمات القطع المحددة. التطبيقات: هضم إنزيمات القطع. المواصفات: تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: حضانة محلول NEBuffer™ r2.1 بتركيز 1X عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. محلول NEBuffer™ r2.1 بتركيز 1X، 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 10 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer : NEBuffer™ r1.1: 100%، NEBuffer™ r2.1: 100%، NEBuffer™ r3.1: 50%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف: محلول التخزين المخفف B: 10 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. تسخين. تعطيل الإنزيم عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: غير حساسة. الأسئلة الشائعة : س: هل يلزم عدد أكبر من وحدات SphI لقطع الحمض النووي فائق الالتفاف مقارنةً بالحمض النووي لامدا؟ ج: نعم، يلزم 4 وحدات لقطع 1 ميكروغرام من حمض الليتموس النووي، ووحدتان لـ pBR322، و3 وحدات لـ pUC19. س: ما هو نشاط SphI عند 25 درجة مئوية؟ ج: يتراوح نشاط SphI بين 50 و75% عند 25 درجة مئوية. س: هل ينتج SphI نهايات متوافقة شائعة الاستخدام؟ ج: يقطع ليترك امتداد 3' CATG الذي يمكن ربطه بكفاءة بقطع الحمض النووي الناتجة عن NlaIII. س: ما هو الوزن الجزيئي لـ SphI؟ ج: يبلغ الوزن الجزيئي لـ SphI 29 كيلو دالتون، كما تم تقديره بواسطة PAGE. س: ما هو النشاط النجمي وكيف يمكن تجنبه؟ ج: لقد ثبت أنه في ظل ظروف غير قياسية قاسية، تستطيع إنزيمات القطع المحددة شطر تسلسلات مشابهة لتسلسل التعرف المحدد لها، ولكنها ليست مطابقة له. يُطلق على هذا التغير في الخصوصية أو انخفاضها اسم "النشاط النجمي". وقد أشير إلى أن النشاط النجمي قد يكون خاصية عامة لإنزيمات القطع المحددة، وأنه يمكن جعل أي إنزيم قطع محدد يشطر مواقع غير نمطية في ظل ظروف قاسية معينة. وتعتمد طريقة تغير خصوصية الإنزيم على نوع الإنزيم والظروف المستخدمة لتحفيز النشاط النجمي. ومن أكثر أنواع النشاط المتغير شيوعًا استبدال قاعدة واحدة، وقص القواعد الخارجية في تسلسل التعرف، وقطع أحد خيوط الحمض النووي. ويمكن التحكم في النشاط النجمي بشكل كامل في الغالبية العظمى من الحالات، ولا يُعدّ مصدر قلق عند إجراء عمليات هضم الحمض النووي باستخدام إنزيمات القطع المحددة. لن تُظهر إنزيمات شركة نيو إنجلاند بيولابس نشاطًا غير طبيعي عند استخدامها في الظروف الموصى بها مع محاليل NEBuffers المرفقة. فيما يلي ظروف التفاعل المعروفة بتحفيز أو تثبيط هذا النشاط. الظروف التي تُسهم في النشاط غير الطبيعي: 1. تركيز عالٍ من الجلسرين [> 5% حجم/حجم] 2. نسبة عالية من الوحدات إلى ميكروغرام من الحمض النووي [تختلف باختلاف كل إنزيم، وعادةً ما تكون > 100 وحدة/ميكروغرام] 3. قوة أيونية منخفضة [< 25 ملي مولار] 4. درجة حموضة عالية [> 8.0] 5. وجود مذيبات عضوية [ثنائي ميثيل سلفوكسيد، إيثانول، إيثيلين جليكول، ثنائي ميثيل أسيتاميد، ثنائي ميثيل فورماميد، سلفالان] 6. استبدال أيونات المغنيسيوم (Mg++) بأيونات ثنائية التكافؤ أخرى [منغنيز (Mn++)، نحاس (Cu++)، كوبالت (Co++)، زنك (Zn++] تثبيط النشاط غير الطبيعي: إذا كنت قلقًا بشأن النشاط غير الطبيعي، فنوصي باتباع الإرشادات التالية: 1. استخدم أقل عدد ممكن من الوحدات للحصول على هضم كامل. هذا يمنع الهضم المفرط ويقلل من تركيز الجلسرين النهائي في التفاعل. ٢. تأكد من خلو التفاعل من أي مذيبات عضوية مثل الكحولات التي قد تكون موجودة في تحضير الحمض النووي. ٣. ارفع القوة الأيونية لمحلول التفاعل إلى ١٠٠-١٥٠ ملي مولار (شريطة ألا يكون الإنزيم مثبطًا بتركيز عالٍ من الملح). ٤. اخفض الرقم الهيدروجيني لمحلول التفاعل إلى ٧.٠. ٥. استخدم أيونات المغنيسيوم (Mg++) كأيون ثنائي التكافؤ. س: هل هذا الإنزيم حساس لـ Dam أو Dcm أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: لا. هذا الإنزيم غير حساس لـ Dam أو Dcm أو مثيلة CpG في الثدييات. للحصول على معلومات محدثة حول حساسية المثيلة، يرجى زيارة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من BSA إلى الألبومين المؤتلف (rAlbumin) في NEBuffers؟ يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونرى أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر.