مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R0194S، XmnI

تمت إعادة صياغة XmnI باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10119487. الفئات ذات الصلة: إنزيمات القطع المحددة TZ، إنزيمات القطع المحددة الموفرة للوقت. التطبيقات: هضم إنزيم القطع. المواصفات: تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 50%، NEBuffer™ r2.1: 75%، NEBuffer™ r3.1: <10%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف A، محلول التخزين : 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 50 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. تعطيل حراري عند 25 درجة مئوية، ثم عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: غير حساسة. الأسئلة الشائعة: س: هل يجب أن تكون مواقع التعرف المتغيرة متناظرة؟ ج: معظم مواقع التعرف على إنزيمات التقييد متناظرة وتتضمن أزواج قواعد محددة فقط (مثل EcoRI الذي يتعرف على GAATTC). مع ذلك، تحتوي بعض الإنزيمات على مواقع متغيرة، أي أنها تحتوي على زوج قاعدة واحد أو أكثر غير محدد بدقة (مثل BsrFI-v2 الذي يتعرف على RCCGGY، حيث R = A أو G و Y = C أو T). بالنسبة للإنزيمات المتغيرة، يمكن أن توجد أي قاعدة ممثلة بالرمز المكون من حرف واحد في أي من موقعي التعرف لحدوث القطع. على سبيل المثال، يتعرف BsrFI-v2 على جميع التسلسلات التالية: ACCGGC، ACCGGT، GCCGGC، GCCGGT. س: ما هو النشاط النجمي وكيف يمكن تجنبه؟ ج: لقد ثبت أنه في ظل ظروف غير قياسية قاسية، تستطيع إنزيمات القطع المحددة شطر تسلسلات مشابهة لتسلسل التعرف المحدد لها، ولكنها ليست مطابقة له. يُطلق على هذا التغير في الخصوصية أو انخفاضها اسم "النشاط النجمي". وقد أشير إلى أن النشاط النجمي قد يكون خاصية عامة لإنزيمات القطع المحددة، وأنه يمكن جعل أي إنزيم قطع محدد يشطر مواقع غير نمطية في ظل ظروف قاسية معينة. وتعتمد طريقة تغير خصوصية الإنزيم على نوع الإنزيم والظروف المستخدمة لتحفيز النشاط النجمي. ومن أكثر أنواع النشاط المتغير شيوعًا استبدال قاعدة واحدة، وقص القواعد الخارجية في تسلسل التعرف، وقطع أحد خيوط الحمض النووي. ويمكن التحكم في النشاط النجمي بشكل كامل في الغالبية العظمى من الحالات، ولا يُعدّ مصدر قلق عند إجراء عمليات هضم الحمض النووي باستخدام إنزيمات القطع المحددة. لن تُظهر إنزيمات شركة نيو إنجلاند بيولابس نشاطًا غير طبيعي عند استخدامها في الظروف الموصى بها مع محاليل NEBuffers المرفقة. فيما يلي ظروف التفاعل المعروفة بتحفيز أو تثبيط هذا النشاط. الظروف التي تُسهم في النشاط غير الطبيعي: 1. تركيز عالٍ من الجلسرين [> 5% حجم/حجم] 2. نسبة عالية من الوحدات إلى ميكروغرام من الحمض النووي [تختلف باختلاف كل إنزيم، وعادةً ما تكون > 100 وحدة/ميكروغرام] 3. قوة أيونية منخفضة [< 25 ملي مولار] 4. درجة حموضة عالية [> 8.0] 5. وجود مذيبات عضوية [ثنائي ميثيل سلفوكسيد، إيثانول، إيثيلين جليكول، ثنائي ميثيل أسيتاميد، ثنائي ميثيل فورماميد، سلفالان] 6. استبدال أيونات المغنيسيوم (Mg++) بأيونات ثنائية التكافؤ أخرى [منغنيز (Mn++)، نحاس (Cu++)، كوبالت (Co++)، زنك (Zn++] تثبيط النشاط غير الطبيعي: إذا كنت قلقًا بشأن النشاط غير الطبيعي، فنوصي باتباع الإرشادات التالية: 1. استخدم أقل عدد ممكن من الوحدات للحصول على هضم كامل. هذا يمنع الهضم المفرط ويقلل من تركيز الجلسرين النهائي في التفاعل. ٢. تأكد من خلو التفاعل من أي مذيبات عضوية مثل الكحولات التي قد تكون موجودة في تحضير الحمض النووي. ٣. ارفع القوة الأيونية لمحلول التفاعل إلى ١٠٠-١٥٠ ملي مولار (شريطة ألا يكون الإنزيم مثبطًا بسبب ارتفاع تركيز الملح). ٤. اخفض الرقم الهيدروجيني لمحلول التفاعل إلى ٧.٠. ٥. استخدم أيونات المغنيسيوم (Mg++) كأيون ثنائي التكافؤ. س: هل يجب عليّ تحضير عمليات الهضم باستخدام إنزيمات Time-Saver™ المعتمدة لمدة ٥-١٥ دقيقة؟ هل يمكنني الهضم لفترة أطول؟ ج: تتميز إنزيمات Time-Saver™ من NEB بسرعة عملها (٥-١٥ دقيقة)، كما أنها مصممة ومؤهلة لتحمل عمليات الهضم طوال الليل دون تحلل الحمض النووي. س: اختبرت إنزيم التقييد الخاص بكم على الحمض النووي الركيزة الموصى به من NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي تؤثر على نشاط الإنزيم. قد تُثبط الأملاح الموجودة في التفاعل إنزيمات القطع النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات التركيز الملحي العالي). قد تُؤدي إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي إلى محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الأملاح، والتي قد تنتقل إلى التفاعل وتُثبط نشاط الإنزيم. لتجنب ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المُضاف إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. يُمكن تحقيق ذلك بتعديل إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: ما هي إنزيمات القطع من NEB المُرفقة بصبغة تحميل الجل، البنفسجي (6X)؟ ج: جميع إنزيمات القطع HF ومعظم إنزيمات القطع غير HF من NEB مُرفقة بصبغة تحميل الجل، البنفسجي (6X). الإنزيمات المقيدة غير HF التي تأتي مع الصبغة الأرجوانية هي: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI Sali XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * يتم أيضًا توفير جميع إنزيمات تقييد HF مع تحميل الجل صبغ، بنفسجي (6X) س: هل هذا؟ هل هذا الإنزيم حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: لا. هذا الإنزيم غير حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات. للحصول على أحدث المعلومات حول حساسية المثيلة، يُرجى زيارة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل تُوفر NEB أي إنزيمات تقييد خالية من BSA و/أو خالية من المكونات الحيوانية لتسلسل البلازميدات في تطوير لقاحات mRNA؟ ج: نعم، قامت NEB بتطوير بعض إنزيمات التقييد (بما في ذلك BspQI، وهو نظير SapI) بدون مكونات حيوانية المنشأ، ولا يحتوي تركيبها النهائي على BSA. بالإضافة إلى ذلك، لدينا العديد من إنزيمات التقييد المتاحة بدون BSA أو أي مكونات حيوانية المنشأ في تركيبها النهائي. تتضمن هذه القائمة: BbsI-HF، BsaI-HFv2، BspQI (نظير LguI)، BspQI-HF (متوفر الآن بدرجة GMP*)، ClaI، HindIII-HF، PacI، SapI، SpeI، SwaI، XbaI، XhoI، XmnI. يمكن تحضير إنزيمات أخرى حسب الطلب. يُرجى الاستفسار هنا. * "درجة GMP" و"درجة GMP" مصطلحان تجاريان تستخدمهما شركة NEB لوصف المنتجات المصنعة أو النهائية في منشأة Rowley التابعة لها. صُممت منشأة Rowley لتصنيع المنتجات وفقًا لبنية تحتية وضوابط عمليات أكثر صرامة لتحقيق مواصفات منتجات أكثر دقة وتلبية متطلبات العملاء. تُصنع المنتجات في منشأة Rowley التابعة لشركة NEB وفقًا لمعايير نظام إدارة الجودة ISO 9001 وISO 13485. مع ذلك، لا تقوم NEB حاليًا بتصنيع أو بيع المنتجات المعروفة باسم المكونات الصيدلانية الفعالة (APIs)، كما أنها لا تُصنّع منتجاتها بما يتوافق مع جميع لوائح ممارسات التصنيع الجيدة الحالية. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من الألبومين البقري المصل (BSA) إلى الألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري المصل (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونعتقد أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر.