مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R0513S، AlwI

تم إيقاف إنتاج الحجم الكبير من هذا المنتج في 15 ديسمبر 2025. وسيظل الحجم الصغير متوفرًا. الفئات ذات الصلة : إنزيمات القطع المحددة: التطبيقات، مواصفات هضم إنزيمات القطع، تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ (dam-) في ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 50%، NEBuffer™ r2.1: 50%، NEBuffer™ r3.1: 10%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف أ: محلول التخزين ، 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 50 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 1 ملي مولار داي ثيو ثريتول، 0.1 ملي مولار إيديتات ثنائي الصوديوم، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. تعطيل حراري عند 25 درجة مئوية، لا حساسية للمثيلة، مثيلة dam: محظورة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: غير حساسة. الأسئلة الشائعة: س: هل يتم حظر AlwI بواسطة مثيلة dam؟ ج: نعم. س: لماذا يصعب ربط الحمض النووي المقطوع بواسطة AlwI؟ ج: النهايات المتدلية أحادية القاعدة هي ركائز ضعيفة لإنزيم T4 DNA ligase: فهي تلتصق بشكل ضعيف للغاية، ويصعب ربطها مثل شظايا الحمض النووي ذات النهايات غير المتداخلة. أيضًا، بالنسبة لـ AlwI، لا تقتصر النهاية المتدلية على أي نيوكليوتيد معين؛ فجميع القواعد الأربع ممثلة بالتساوي تقريبًا. وبالتالي، فإن أي نهاية متدلية معينة تكون متوافقة مع 25% فقط من النهايات المتدلية الأخرى الموجودة. هذا يقلل من كفاءة الربط مقارنةً بالنهايات المتدلية الناتجة عن إنزيمات التقييد التي تترك فقط نهايات متدلية متوافقة. يمكن زيادة كفاءة الربط باستخدام مزيج Blunt/TA Ligase Master Mix الخاص بنا. س: لماذا لا يُنصح بالهضم المطول؟ ج: لأن هناك نشاطًا نوكليازيًا خارجيًا أو نوكليازيًا داخليًا غير متخصص، ويبدو أنه من خصائص الإنزيم. س: اختبرتُ إنزيم التقييد الخاص بكم على الحمض النووي الركيزة الموصى به من قِبل NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي تؤثر على نشاط الإنزيم. قد تُثبَّط إنزيمات التقييد النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات الملوحة العالية)، بسبب وجود الملح في التفاعل. قد تُؤدي إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي إلى محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الملح، والتي قد تنتقل إلى التفاعل وتُثبِّط نشاط الإنزيم. لمنع ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المُضاف إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق تعديل إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من الألبومين البقري المصل (BSA) إلى الألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري المصل (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونعتقد أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر.