مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R0539S، BbsI

تعرف على دقة الليغاز وتجاوز حدود الفئات ذات الصلة من إنزيمات القطع المحددة B، تطبيقات إنزيمات القطع المحددة المؤهلة لتوفير الوقت، تجميع NEBridge® Golden Gate، الاستنساخ السريع: تسريع عمليات الاستنساخ الخاصة بك باستخدام الكواشف من NEB، مواصفات هضم إنزيم القطع، تعريف الوحدة: تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: حضانة محلول NEBuffer™ r2.1 بتركيز 1X عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. محلول NEBuffer™ r2.1 بتركيز 1X، 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 10 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer : NEBuffer™ r1.1: 100%، NEBuffer™ r2.1: 100%، NEBuffer™ r3.1: 25%، محلول rCutSmart™: 75%. توافق المخفف: محلول التخزين المخفف B: 10 ملي مولار Tris-HCl، 300 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 500 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. تسخين. تعطيل عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: غير حساسة. الأسئلة الشائعة: س: هل يجب عليّ تحضير الهضم باستخدام إنزيمات Time-Saver™ لمدة 5-15 دقيقة؟ هل يمكنني الهضم لفترة أطول؟ ج: تتميز إنزيمات Time-Saver™ من NEB بسرعة عملها (5-15 دقيقة)، كما أنها مصممة ومؤهلة لتحمل الهضم طوال الليل دون تلف الحمض النووي. س: ما هو نشاط إنزيم BbsI عند 25 درجة مئوية؟ ج: يكون إنزيم BbsI نشطًا بنسبة 25% تقريبًا عند 25 درجة مئوية. س: ما هي إنزيمات التقييد من NEB المزودة بصبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X)؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF ومعظم إنزيمات التقييد غير HF من NEB مزودة بصبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X). الإنزيمات المقيدة غير HF التي تأتي مع الصبغة الأرجوانية هي: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI Sali XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * يتم أيضًا توفير جميع إنزيمات تقييد HF مع تحميل الجل الصبغة الأرجوانية (6X) س: أي قيد هل تُستخدم الإنزيمات في تجميع GoldenBraid؟ ج: يُعدّ BsaI أحد إنزيمات النوع IIS المستخدمة في هذه الطريقة. كما تُقدّم NEB نسخة مُهندسة عالية الدقة من هذا الإنزيم، BsaI-HF®v2، والتي تتميّز بكونها مُؤهّلة لتوفير الوقت (حيث يُمكنها هضم الحمض النووي في غضون 5-15 دقيقة، ويمكن هضمها بأمان طوال الليل)، وتُظهر نشاطًا نجميًا مُنخفضًا. يعمل BsaI-HFv2 في محلول CutSmart®، كما هو الحال مع إنزيم T4 DNA Ligase (وهو أيضًا جزء من سير عمل GoldenBraid)، والذي يكون نشطًا وظيفيًا بنسبة 100% في هذا المحلول، عند إضافة 1 ملي مول من ATP إلى التفاعل. تشمل إنزيمات النوع IIS الأخرى المُستخدمة في GoldenBraid: BsmBI-v2/Esp3I، وBtgZI، وBbsI/BbsI-HF، وPaqCI (نظير AarI مع تسلسل تعرّف 7 أزواج قاعدية). المرجع: GoldenBraid 2.0: إطار عمل شامل لتجميع الحمض النووي في البيولوجيا التركيبية النباتية. س: ما هي إنزيمات التقييد المستخدمة في تجميع Golden Gate؟ ج: تجميع Golden Gate هو طريقة استنساخ فعالة أحادية الأنبوب تعتمد على إنزيمات التقييد من النوع IIS التي تقطع خارج مواقع التعرف الخاصة بها وتترك نهايات بارزة من 3 أو 4 قواعد. يُعد BsaI أكثر إنزيمات النوع IIS استخدامًا في تجميع Golden Gate. كما تُقدم NEB نسخة مُهندسة عالية الدقة من هذا الإنزيم، BsaI-HF®v2، والتي تتميز بميزة إضافية وهي كونها مُؤهلة لتوفير الوقت (حيث يمكنها هضم الحمض النووي في غضون 5-15 دقيقة أو طوال الليل دون تحلله) وتُظهر نشاطًا نجميًا مُنخفضًا بشكل كبير. تشمل إنزيمات النوع IIS الأخرى المستخدمة في تجميع Golden Gate: BsmBI-v2/Esp3I، وBbsI/BbsI-HF، وPaqCI (نظير AarI مع تسلسل تعرف مكون من 7 أزواج قاعدية)، وSapI/BspQI/BspQI-HF (مع تسلسل تعرف مكون من 7 أزواج قاعدية وامتدادات مكونة من 3 أزواج قاعدية). س: هل هذا الإنزيم حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: لا. هذا الإنزيم غير حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات. للحصول على معلومات محدثة حول حساسية المثيلة، يُرجى زيارة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من BSA إلى الألبومين المؤتلف (rAlbumin) في NEBuffers؟ ج: يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على BSA (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونعتقد أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر. س: ما هي شروط تخزين BbsI؟ ج: يمكن تخزين BbsI عند درجة حرارة -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية. س: بالنسبة للإنزيمات المخزنة عند -80 درجة مئوية، هل تتأثر فعاليتها بعد عدة دورات من التجميد والذوبان؟ ج: حافظت الإنزيمات التالية على فعاليتها الكاملة عند اختبارها لعشر دورات من التجميد والذوبان. إذا كنت بحاجة إلى أكثر من 10 دورات تجميد وإذابة، فنوصي بتقسيم الإنزيم إلى أحجام أصغر وتجميد كل جزء عند -80 درجة مئوية. Cac8I EagI-HF I-SceI KasI NlaIII ملاحظة: حافظ FseI على نشاطه الكامل لمدة 5 دورات تجميد/إذابة فقط.