نيو إنجلاند بيولابس، R0544S، كاسي

تمت إعادة صياغة إنزيم KasI باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10211225. الفئات ذات الصلة: إنزيمات القطع المحددة، تطبيقات HM، مواصفات هضم إنزيم القطع، تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي pBR322 في ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار تريس-أسيتات، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 50%، NEBuffer™ r2.1: 100%، NEBuffer™ r3.1: 50%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف B، محلول التخزين : 100 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 1 ملي مولار داي ثيو ثريتول، 0.1 ملي مولار إيديتات ثنائي الصوديوم، 50% جلسرين، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، الأس الهيدروجيني 7 عند 25 درجة مئوية. تعطيل بالحرارة عند 25 درجة مئوية، ثم عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: محظورة. الأسئلة الشائعة: س: هل يتأثر إنزيم KasI بالمثيلة؟ ج: يتم حجب إنزيم KasI بواسطة مثيلة CpG. للحصول على معلومات محدثة حول حساسية المثيلة، يرجى زيارة صفحة مثيلة Dam-Dcm وCpG أو REBASE. س: هل يُنصح بالهضم المطول لإنزيم KasI؟ ج: الهضم المطول غير مفيد لأن الإنزيم غير مستقر في التفاعل. س: هل يلزم عدد أكبر من وحدات KasI لقطع الحمض النووي فائق الالتفاف مقارنةً بالحمض النووي لامدا؟ ج: نعم، يلزم 4 وحدات لقطع 1 ميكروغرام من الحمض النووي litmus. س: هل يُلاحظ فقدان نشاط إنزيم KasI خلال 6 أشهر أو أقل؟ ج: نعم، يمكن ملاحظة فقدان النشاط بعد 6 أشهر من التخزين عند -20 درجة مئوية. يجب تخزين إنزيم KasI عند -80 درجة مئوية. لتجنب التجميد والذوبان المتكررين، يُرجى تقسيم الإنزيم إلى أجزاء صغيرة وتخزينه عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. س: اختبرتُ إنزيم القطع الخاص بكم على الحمض النووي الركيزة الموصى به من قِبل شركة NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي تؤثر على نشاط الإنزيم. قد تُثبَّط إنزيمات القطع النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات الملوحة العالية)، بسبب وجود الملح في التفاعل. قد تُؤدي إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي إلى محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الملح، والتي قد تنتقل إلى التفاعل وتُثبِّط نشاط الإنزيم. لمنع ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المُضاف إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. يُمكن تحقيق ذلك عن طريق تعديل إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: ما هي المتماثلات الإنزيمية؟ ج: تبيع شركة NEB نوعين من مُنشِّطات KasI الجديدة. يقوم KasI بقطع تسلسل G/GCGCC، بينما يقوم NarI بقطع تسلسل GG/CGCC، أما SfoI فيقطع ليترك نهايات GGC/GCC غير لاصقة. يتميز كل من KasI وNarI بتفضيل مواقع معينة، حيث يقطعان بعض المواقع ببطء شديد. أما SfoI فلا يُظهر تفضيلًا لمواقع معينة. س: هل توجد مواقع بطيئة في النواقل الشائعة؟ ج: يكون Kas أكثر نشاطًا بمقدار 25 ضعفًا على ناقل lambda مقارنةً بناقل pBR3222. لم يتم تحديد مواقع القطع البطيئة. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من BSA إلى الألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على BSA (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونعتقد أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر. س: بالنسبة للإنزيمات المخزنة عند -80 درجة مئوية، هل تتأثر فعاليتها بعد عدة دورات من التجميد والذوبان؟ ج: حافظت الإنزيمات التالية على فعاليتها الكاملة عند اختبارها لعشر دورات من التجميد والذوبان. إذا كنت بحاجة إلى أكثر من عشر دورات، فننصح بتقسيم الإنزيم إلى أجزاء أصغر وتجميد كل جزء عند -80 درجة مئوية. Cac8I EagI-HF I-SceI KasI NlaIII يرجى الملاحظة: حافظ FseI على نشاطه الكامل لمدة 5 دورات تجميد/ذوبان فقط.