مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R0559L، BsgI

تمت إعادة صياغة BsgI باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10201941. الفئات ذات الصلة: إنزيمات القطع المحددة B، تطبيقات إنزيمات القطع المحددة الموفرة للوقت: الاستنساخ السريع: تسريع عمليات الاستنساخ باستخدام الكواشف من NEB، مواصفات هضم إنزيم القطع، تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار تريس-أسيتات، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 25%، NEBuffer™ r2.1: 50%، NEBuffer™ r3.1: 25%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف B، محلول التخزين : 300 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 1 ملي مولار داي ثيو ثريتول، 0.1 ملي مولار إيديتات ثنائي الصوديوم، 0.32 ملي مولار إس-أدينوسيل ميثيونين (SAM)، 500 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب ألبومين 50% جلسرين، درجة الحموضة 7.4 عند 25 درجة مئوية ، تعطيل حراري عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: غير حساسة. الأسئلة الشائعة : س: لماذا لا يقطع BsgI جيدًا؟ ج: يتطلب BsgI وجود 80 ميكرومول من SAM في مزيج التفاعل. ينتج عن الحضانة بدون SAM نشاط بنسبة 25-50%. يجب أن يكون SAM طازجًا. نقترح تحضير SAM قبل الاستخدام مباشرة، بل وتقسيمه إلى حصص مركزة حتى لا يتعرض للعديد من دورات التجميد والذوبان. حتى عند -70 درجة مئوية، يدوم لمدة ستة أشهر تقريبًا. يفقد كل من BsgI وSAM نشاطهما في عمليات الهضم الليلية، لذلك لا يُنصح باستخدامهما. من الأفضل إضافة المزيد من وحدات BsgI وتدعيمه مرة واحدة بـ SAM طازج بدلاً من إجراء عملية هضم ليلية. يُثبَّط إنزيم BsgI أيضًا بواسطة النيوكليوتيدات وملوثات الحمض النووي. يمكن أن يؤدي غسل الحمض النووي بالتنقيط إلى زيادة معدل القطع. س: ما هو نشاط إنزيم BsgI عند درجة حرارة 25 درجة مئوية؟ ج: يكون إنزيم BsgI نشطًا بنسبة 100% عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. س: هل توجد أخطاء تسلسل معروفة في موقع التعرف في قاعدة البيانات؟ ج: نعم. يقطع إنزيم BsgI الحمض النووي phiX174؛ وقد نُسبت التقارير التي تفيد بعدم وجود موقع BsgI في هذا الحمض النووي إلى خطأ في التسلسل. س: هل يجب عليّ إعداد عمليات الهضم باستخدام إنزيمات Time-Saver™ المؤهلة لمدة 5-15 دقيقة؟ هل يمكنني الهضم لفترة أطول؟ ج: تتميز إنزيمات Time-Saver™ من NEB بسرعة عملها (5-15 دقيقة)، كما أنها مصممة ومؤهلة لتحمل عمليات الهضم طوال الليل دون تحلل الحمض النووي. س: اختبرت إنزيم التقييد الخاص بكم على الحمض النووي الركيزة الموصى به من NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي تؤثر على نشاط الإنزيم. قد تُثبط الأملاح الموجودة في التفاعل إنزيمات القطع النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات التركيز الملحي العالي). قد تُؤدي إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي إلى محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الأملاح، والتي قد تنتقل إلى التفاعل وتُثبط نشاط الإنزيم. لتجنب ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المُضاف إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. يُمكن تحقيق ذلك بتعديل إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: هل هذا الإنزيم حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: لا. هذا الإنزيم غير حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات. للحصول على معلومات مُحدثة حول حساسية المثيلة، يُرجى زيارة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل يتطلب إنزيم BsgI وجود SAM للنشاط؟ ج: نعم، S-أدينوسيل ميثيونين (SAM) ضروري للنشاط الأمثل (يُضاف SAM إلى تركيبة الإنزيم اعتبارًا من أكتوبر 2020). إذا لم تكن متأكدًا مما إذا كان SAM موجودًا في تركيبة الإنزيم، ولديك قارورة من SAM من شركة NEB، فلا بأس من إضافته إلى التفاعل وفقًا للإرشادات السابقة. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن استبدال BSA بالألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ شركة NEB أن تُعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على BSA (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل rAlbumin. نشعر أن الابتعاد عن المنتجات التي تحتوي على مكونات حيوانية هو خطوة في الاتجاه الصحيح، ونحن قادرون على تقديم هذا التحسين بنفس السعر.