مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R0583L، Tsp45I

الفئات ذات الصلة: إنزيمات القطع المحددة، تطبيقات TZ، مواصفات هضم إنزيم القطع، تعريف الوحدة: تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند 65 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 65 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 100%، NEBuffer™ r2.1: 50%، NEBuffer™ r3.1: <10%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف أ: محلول التخزين ، 20 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 200 ميكروغرام/مل BSA، 50% جلسرين، 0.15% تريتون® X-100، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. تعطيل حراري عند 25 درجة مئوية، لا حساسية للمثيلة، مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: غير حساسة، النشاط عند درجة حرارة 37 درجة مئوية: 10% ، أسئلة شائعة: س: هل يجب أن تكون مواقع التعرف المتغيرة متناظرة؟ ج: معظم مواقع التعرف لإنزيمات التقييد متناظرة وتتضمن أزواج قواعد محددة فقط (مثل EcoRI يتعرف على GAATTC). ومع ذلك، تحتوي بعض الإنزيمات على مواقع متغيرة، مما يعني أنها تحتوي على زوج قاعدة واحد أو أكثر غير محدد (مثل BsrFI-v2 يتعرف على RCCGGY، حيث R = A أو G و Y = C أو T). بالنسبة للإنزيمات المتغيرة، يمكن أن توجد أي قاعدة ممثلة برمز الحرف الواحد في أي من الموقعين في موقع التعرف لحدوث الانقسام. على سبيل المثال، يتعرف BsrFI-v2 على جميع التسلسلات التالية: ACCGGC، ACCGGT، GCCGGC، GCCGGT. س: كيف يمكن تعطيل هذا الإنزيم؟ ج: لتعطيل الإنزيمات التي لا يمكن تعطيلها بالحرارة، نوصي باستخلاص الفينول متبوعًا بالترسيب بالإيثانول أو استخدام عمود طرد مركزي تجاري مصمم لتنقية الحمض النووي. س: اختبرت إنزيم القطع الخاص بكم على الحمض النووي الركيزة الموصى به من قبل NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي تؤثر على نشاط الإنزيم. إنزيمات القطع النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات الملوحة العالية)، قد تُثبط بفعل الملح في التفاعل. إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي قد تُنتج محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الملح، والتي قد تنتقل إلى التفاعل وتُثبط نشاط الإنزيم. لمنع ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المُضاف إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. يمكن تحقيق ذلك بتعديل حجم التفاعل الكلي وفقًا لذلك. س: هل هذا الإنزيم حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: لا. هذا الإنزيم غير حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات. للحصول على معلومات محدثة حول حساسية المثيلة، يُرجى زيارة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من BSA إلى الألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على BSA (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المؤتلف (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). نعمل حاليًا على تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونعتقد أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونستطيع تقديم هذا التحسين بنفس السعر.