مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R0596L، BciVI

تمت إعادة صياغة BciVI باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10317355. الفئات ذات الصلة : إنزيمات القطع المحددة B، إنزيمات القطع المؤهلة لتوفير الوقت. التطبيقات: هضم إنزيم القطع. المواصفات: تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 100%، NEBuffer™ r2.1: 25%، NEBuffer™ r3.1: أقل من 10%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف: محلول التخزين المخفف C: 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 250 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار داي ثيو ثريتول، 0.1 ملي مولار إيديتات ثنائي الصوديوم، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، 0.15% تريتون®. X-100، درجة الحموضة 7.4 عند 25 درجة مئوية، تعطيل حراري عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: غير حساسة. الأسئلة الشائعة : س: هل يُثبط الملح إنزيم BciVI؟ ج: ينخفض ​​النشاط عند تركيز كلوريد الصوديوم أعلى من 50 ملي مولار. يُنصح بغسل الحمض النووي المُحضر بكميات صغيرة باستخدام الإيثانول بنسبة 70%. س: هل يُنصح بهضم BciVI لفترة طويلة؟ ج: الهضم لفترة طويلة غير مفيد لأن الإنزيم غير مستقر أثناء التفاعل. س: لماذا يصعب ربط الحمض النووي المقطوع بواسطة BciVI؟ ج: تُعد النهايات المتدلية أحادية الزوج القاعدي ركائز ضعيفة لإنزيم T4 DNA ligase: فهي تلتصق بشكل ضعيف للغاية، ويصعب ربطها مثل شظايا الحمض النووي ذات النهايات غير المتداخلة. أيضًا، بالنسبة لإنزيم AlwI، لا يقتصر التدلي على نيوكليوتيد معين؛ فجميع القواعد الأربع ممثلة بالتساوي تقريبًا. وبالتالي، فإن أي نتوء معين يكون متوافقًا مع 25% فقط من النتوءات الأخرى الموجودة. هذا يقلل من كفاءة الربط مقارنةً بالنتوءات الناتجة عن إنزيمات التقييد التي لا تُنتج إلا نتوءات متوافقة فيما بينها. يمكن زيادة كفاءة الربط باستخدام مزيج الربط الرئيسي Blunt/TA Ligase Master Mix الخاص بنا. س: هل موقع التعرف غير متناظر؟ ج: نعم. يمكن قراءة تسلسل التعرف إما كـ GTATCC أو GGATAC. س: هل يجب عليّ إعداد عمليات الهضم باستخدام إنزيمات Time-Saver™ المؤهلة لمدة 5-15 دقيقة؟ هل يمكنني الهضم لفترة أطول؟ ج: تتميز إنزيمات Time-Saver™ من NEB بسرعة عملها (5-15 دقيقة)، كما أنها مصممة ومؤهلة لتحمل عمليات الهضم طوال الليل دون تحلل الحمض النووي. س: اختبرت إنزيم التقييد الخاص بكم على الحمض النووي الركيزة الموصى به من NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي يمكن أن تؤثر على نشاط الإنزيم. قد تُثبَّط إنزيمات القطع النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلولي NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات التركيز الملحي العالي)، بفعل الملح في التفاعل. قد تُنتج إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الملح، والتي قد تنتقل إلى التفاعل وتُثبِّط نشاط الإنزيم. ولمنع ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المُضاف إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. ويمكن تحقيق ذلك بتعديل إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: هل هذا الإنزيم حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: لا. هذا الإنزيم غير حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات. للحصول على معلومات مُحدَّثة حول حساسية المثيلة، يُرجى زيارة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل تتأثر فعالية الإنزيمات المخزنة عند درجة حرارة -80 درجة مئوية بعد عدة دورات من التجميد والذوبان؟ ج: حافظت الإنزيمات التالية على فعاليتها الكاملة عند اختبارها لعشر دورات من التجميد والذوبان. إذا كنت بحاجة إلى أكثر من عشر دورات، فننصح بتقسيم الإنزيم إلى أجزاء أصغر وتجميد كل جزء على حدة عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. Cac8I EagI-HF I-SceI KasI NlaIII ملاحظة: حافظ إنزيم FseI على فعاليته الكاملة لخمس دورات فقط من التجميد والذوبان.