مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R0603L، SgrAI

تمت إعادة صياغة SgrAI باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10196887. الفئات ذات الصلة: إنزيمات القطع المحددة. التطبيقات: هضم إنزيمات القطع. المواصفات: تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 100%، NEBuffer™ r2.1: 100%، NEBuffer™ r3.1: 10%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف أ: محلول التخزين ، 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 100 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار داي ثيو ثريتول، 0.1 ملي مولار إيديتات ثنائي الصوديوم، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. تعطيل حراري عند 25 درجة مئوية، ثم عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: محجوبة. الأسئلة الشائعة : س: ما هو النشاط النجمي وكيف يمكن تجنبه؟ ج: لقد ثبت أنه في ظل ظروف غير قياسية قاسية، تكون إنزيمات القطع قادرة على قطع تسلسلات مشابهة لتسلسل التعرف المحدد لها، ولكنها ليست مطابقة له. يُطلق على هذه الخصوصية المتغيرة أو المتساهلة اسم "النشاط النجمي". وقد اقتُرح أن النشاط النجمي قد يكون خاصية عامة لإنزيمات القطع، وأنه يمكن جعل أي إنزيم قطع يقطع مواقع غير تقليدية في ظل ظروف قاسية معينة. وتعتمد طريقة تغير خصوصية الإنزيم على الإنزيم نفسه وعلى الظروف المستخدمة لتحفيز النشاط النجمي. تشمل أكثر أنواع النشاط المُعدَّل شيوعًا استبدال قاعدة واحدة، وقص القواعد الخارجية في تسلسل التعرُّف، وقطع السلسلة المفردة. يُمكن التحكُّم الكامل في النشاط النجمي في الغالبية العظمى من الحالات، ولا يُشكِّل عادةً مصدر قلق عند إجراء عمليات الهضم باستخدام إنزيمات التقييد. لن تُظهر إنزيمات شركة نيو إنجلاند بيولابس أي نشاط نجمي عند استخدامها في ظل الظروف الموصى بها في محاليل NEBuffers المُرفقة. فيما يلي شروط التفاعل المعروفة بتحفيز أو تثبيط النشاط النجمي. العوامل المساهمة في نشاط الإنزيم النجمي: 1. تركيز عالٍ من الجلسرين [> 5% حجم/حجم] 2. نسبة عالية من الوحدات إلى ميكروغرام من الحمض النووي [تختلف باختلاف الإنزيم، وعادةً ما تكون > 100 وحدة/ميكروغرام] 3. قوة أيونية منخفضة [< 25 ملي مولار] 4. درجة حموضة عالية [> 8.0] 5. وجود مذيبات عضوية [ثنائي ميثيل سلفوكسيد، إيثانول، إيثيلين جليكول، ثنائي ميثيل أسيتاميد، ثنائي ميثيل فورماميد، سلفالان] 6. استبدال أيونات المغنيسيوم (Mg++) بأيونات ثنائية التكافؤ أخرى [منغنيز (Mn++)، نحاس (Cu++)، كوبالت (Co++)، زنك (Zn++] تثبيط النشاط النجمي: إذا كنت قلقًا بشأن النشاط النجمي، نوصي باتباع الإرشادات التالية: 1. استخدم أقل عدد ممكن من الوحدات للحصول على هضم كامل. هذا يمنع الهضم الزائد ويقلل من تركيز الجلسرين النهائي في التفاعل. ٢. تأكد من خلو التفاعل من أي مذيبات عضوية، مثل الكحولات، التي قد تكون موجودة في تحضير الحمض النووي. ٣. ارفع القوة الأيونية لمحلول التفاعل إلى ١٠٠-١٥٠ ملي مولار (شريطة ألا يكون الإنزيم مثبطًا بتركيز عالٍ من الملح). ٤. اخفض الرقم الهيدروجيني لمحلول التفاعل إلى ٧.٠. ٥. استخدم أيونات المغنيسيوم (Mg++) كأيون ثنائي التكافؤ. س: هل يجب أن تكون مواقع التعرف المتغيرة متناظرة؟ ج: معظم مواقع التعرف في إنزيمات القطع متناظرة وتتضمن أزواج قواعد محددة فقط (مثلًا، EcoRI يتعرف على GAATTC). مع ذلك، تحتوي بعض الإنزيمات على مواقع متغيرة، أي أنها تحتوي على زوج أو أكثر من أزواج القواعد غير المحددة بدقة (مثلًا، BsrFI-v2 يتعرف على RCCGGY، حيث R = A أو G و Y = C أو T). بالنسبة للإنزيمات المتغيرة، يمكن أن توجد أي قاعدة ممثلة بالرمز المكون من حرف واحد في أي من موقعي التعرف لحدوث القطع. على سبيل المثال، يتعرف إنزيم BsrFI-v2 على جميع التسلسلات التالية: ACCGGC، ACCGGT، GCCGGC، GCCGGT. س: اختبرتُ إنزيم القطع الخاص بكم على الحمض النووي الركيزة الموصى به من قِبل شركة NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي تؤثر على نشاط الإنزيم. قد تُثبَّط إنزيمات القطع النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات التركيز الملحي العالي)، بسبب وجود الملح في التفاعل. قد تُؤدي إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي إلى محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الملح، والتي قد تنتقل إلى التفاعل وتُثبِّط نشاط الإنزيم. لمنع ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المُضاف إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. يُمكن تحقيق ذلك عن طريق تعديل إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: هل هذا الإنزيم حساس لـ Dam أو Dcm أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: نعم. لا يستطيع هذا الإنزيم قطع مواقع التعرف في الحمض النووي الجينومي للثدييات التي تُحجب بمثيلة CpG. للحصول على أحدث المعلومات حول حساسية المثيلة، يُرجى زيارة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من الألبومين البقري (BSA) إلى الألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ NEB أن تُعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على BSA (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل rAlbumin. نشعر أن الابتعاد عن المنتجات التي تحتوي على مكونات حيوانية هو خطوة في الاتجاه الصحيح، ونحن قادرون على تقديم هذا التحسين بنفس السعر.