مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R0613S، BaeI

تمت إعادة صياغة BaeI باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10281538. الفئات ذات الصلة: إنزيمات القطع المحددة B، تطبيقات إنزيمات القطع المحددة الموفرة للوقت: الاستنساخ السريع: تسريع عمليات الاستنساخ باستخدام الكواشف من NEB، مواصفات هضم إنزيم القطع، تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي لامدا في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 50%، NEBuffer™ r2.1: 100%، NEBuffer™ r3.1: 50%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف A، محلول التخزين : 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 50 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 0.32 ملي مولار S-أدينوسيل ميثيونين (SAM) 50% جلسرين، درجة الحموضة 7.4 عند 25 درجة مئوية، تعطيل حراري عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: مُثبَّطة ببعض تركيبات النشاط المتداخل عند درجة حرارة 25 درجة مئوية: 100%. الأسئلة الشائعة : س: هل لـ BaeI أي متطلبات خاصة؟ ج: نعم، S-أدينوسيل ميثيونين (SAM) ضروري للنشاط الأمثل (يُزوَّد SAM في تركيبة الإنزيم اعتبارًا من يناير 2022). إذا لم تكن متأكدًا مما إذا كان SAM موجودًا في تركيبة الإنزيم ولديك قارورة من SAM من NEB، فلا بأس من إضافة SAM إلى التفاعل وفقًا للإرشادات السابقة. س: هل يقوم BaeI بقطع الحمض النووي مرتين؟ ج: يقوم إنزيم BaeI بقطع ركائز الحمض النووي مرتين لاستئصال موقع التعرف الخاص به، مما ينتج عنه قطعة مكونة من 28 زوجًا قاعديًا مع نهايات بارزة بطول 5 قواعد في الطرف 3'. س: هل يجب عليّ تحضير عمليات الهضم باستخدام إنزيمات Time-Saver™ لمدة 5-15 دقيقة؟ هل يمكنني الهضم لفترة أطول؟ ج: تتميز إنزيمات Time-Saver™ من NEB بسرعة عملها (5-15 دقيقة)، كما أنها مصممة ومؤهلة لتحمل عمليات الهضم طوال الليل دون إتلاف الحمض النووي. س: اختبرت إنزيم القطع الخاص بكم على ركيزة الحمض النووي الموصى بها من NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي تؤثر على نشاط الإنزيم. قد يتم تثبيط إنزيمات القطع النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات الملوحة العالية)، بسبب وجود الملح في التفاعل. قد تُنتج إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي محاليل حمض نووي تحتوي على مستويات عالية من الأملاح، والتي قد تنتقل إلى التفاعل وتُثبّط نشاط الإنزيم. ولمنع ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المُضاف إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. ويمكن تحقيق ذلك بتعديل إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: هل هذا الإنزيم حساس لـ Dam أو Dcm أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: نعم. لا يستطيع هذا الإنزيم قطع مواقع التعرف في الحمض النووي الجينومي للثدييات التي تُحجبها بعض تركيبات مثيلة CpG المتداخلة. للحصول على معلومات مُحدّثة حول حساسية المثيلة، يُرجى زيارة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل يُمكنكم إخباري المزيد عن التحوّل من BSA إلى الألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في NEBuffers؟ ج: يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على BSA (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونعتقد أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر. س: في إطار جهودنا لتوحيد ظروف التفاعل، تم تغيير درجة حرارة الحضانة الموصى بها لإنزيمات ApaI (NEB #R0114)، وBaeI (NEB #R0613)، وBsrDI (NEB #R0574)، وSmaI (NEB #R0141). ما هي درجة حرارة الحضانة المناسبة؟ ج: يمكنك الحضانة بأمان عند أي من درجتي الحرارة. يرجى ملاحظة أنه بالنسبة لإنزيم SmaI، نقترح حضانة العينات عند درجة حرارة 25 درجة مئوية في حال إجراء عمليات هضم مطولة (أكثر من ساعة). س: هل تكون بعض إنزيمات التقييد أكثر نشاطًا عند درجات حرارة حضانة أعلى من الموصى بها؟ ج: إنزيمات التقييد من NEB فعالة بنسبة 100% عند درجة حرارة الحضانة الموصى بها في المحلول المنظم الموصى به والمرفق مع كل إنزيم. مع بعض إنزيمات التقييد المعزولة من الكائنات المحبة للحرارة، قد تلاحظ زيادة في النشاط عند درجات حرارة حضانة أعلى. لا ننصح برفع درجة الحرارة، حيث قد تظهر أنشطة نوكلياز إضافية عند درجات حرارة غير موصى بها.