مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R0630S، AsiSI

الفئات ذات الصلة : إنزيمات القطع المحددة: أ- التطبيقات، مواصفات هضم إنزيمات القطع المحددة، تعريف الوحدة: تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لهضم 1 ميكروغرام من pXba المهضوم بواسطة XhoI في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار من أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار من أسيتات التريس، 10 ملي مولار من أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل من الألبومين المؤتلف (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 100%، NEBuffer™ r2.1: 100%، NEBuffer™ r3.1: 25%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف: المخفف B، محلول التخزين: 10 ملي مولار من Tris-HCl، 300 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار من DTT، 0.1 ملي مولار من EDTA، 500 ميكروغرام/مل من BSA، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. تعطيل حراري عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: محجوبة. الأسئلة الشائعة: س: ما هو النشاط النجمي وكيف يمكن تجنبه؟ ج: لقد ثبت أنه في ظل ظروف غير قياسية قاسية، تكون إنزيمات القطع قادرة على قطع تسلسلات مشابهة لتسلسل التعرف المحدد لها، ولكنها ليست مطابقة له. يُطلق على هذه الخصوصية المتغيرة أو المتساهلة اسم "النشاط النجمي". وقد اقتُرح أن النشاط النجمي قد يكون خاصية عامة لإنزيمات القطع، وأنه يمكن جعل أي إنزيم قطع يقطع مواقع غير تقليدية في ظل ظروف قاسية معينة. تعتمد طريقة تغير خصوصية الإنزيم على الإنزيم نفسه وعلى الظروف المستخدمة لتحفيز النشاط النجمي. من أكثر أنواع النشاط المتغير شيوعًا استبدال قاعدة واحدة، وقص القواعد الخارجية في تسلسل التعرف، وقطع سلسلة مفردة. يمكن التحكم بشكل كامل في النشاط النجمي في الغالبية العظمى من الحالات، ولا يُعدّ مصدر قلق عند إجراء عمليات الهضم باستخدام إنزيمات القطع المحددة. لن تُظهر إنزيمات شركة نيو إنجلاند بيولابس أي نشاط نجمي عند استخدامها في الظروف الموصى بها مع محاليل NEBuffers المرفقة. فيما يلي شروط التفاعل المعروفة بتحفيز أو تثبيط النشاط النجمي. العوامل المساهمة في نشاط الإنزيم النجمي: 1. تركيز عالٍ من الجلسرين [> 5% حجم/حجم] 2. نسبة عالية من الوحدات إلى ميكروغرام من الحمض النووي [تختلف باختلاف الإنزيم، وعادةً ما تكون > 100 وحدة/ميكروغرام] 3. قوة أيونية منخفضة [< 25 ملي مولار] 4. درجة حموضة عالية [> 8.0] 5. وجود مذيبات عضوية [ثنائي ميثيل سلفوكسيد، إيثانول، إيثيلين جليكول، ثنائي ميثيل أسيتاميد، ثنائي ميثيل فورماميد، سلفالان] 6. استبدال أيونات المغنيسيوم (Mg++) بأيونات ثنائية التكافؤ أخرى [منغنيز (Mn++)، نحاس (Cu++)، كوبالت (Co++)، زنك (Zn++] تثبيط النشاط النجمي: إذا كنت قلقًا بشأن النشاط النجمي، نوصي باتباع الإرشادات التالية: 1. استخدم أقل عدد ممكن من الوحدات للحصول على هضم كامل. هذا يمنع الهضم الزائد ويقلل من تركيز الجلسرين النهائي في التفاعل. ٢. تأكد من خلو التفاعل من أي مذيبات عضوية، مثل الكحولات، التي قد تكون موجودة في تحضير الحمض النووي. ٣. ارفع القوة الأيونية لمحلول التفاعل إلى ١٠٠-١٥٠ ملي مولار (شريطة ألا يكون الإنزيم مثبطًا بتركيز عالٍ من الملح). ٤. اخفض الرقم الهيدروجيني لمحلول التفاعل إلى ٧.٠. ٥. استخدم أيونات المغنيسيوم (Mg++) كأيون ثنائي التكافؤ. س: ما هي إنزيمات التقييد من شركة NEB التي تأتي مزودة بصبغة تحميل الجل، بنفسجية (٦X)؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF ومعظم إنزيمات التقييد غير HF من شركة NEB تأتي مزودة بصبغة تحميل الجل، بنفسجية (٦X). الإنزيمات المقيدة غير HF التي تأتي مع الصبغة الأرجوانية هي: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI Sali XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * يتم أيضًا توفير جميع إنزيمات تقييد HF مع تحميل الجل صبغ، بنفسجي (6X) س: هل هذا هل هذا الإنزيم حساس لـ Dam أو DCM أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: نعم. لا يستطيع هذا الإنزيم قطع مواقع التعرف في الحمض النووي الجينومي للثدييات التي تُحجب بمثيلة CpG. للحصول على أحدث المعلومات حول حساسية المثيلة، يُرجى زيارة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من الألبومين البقري (BSA) إلى الألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ NEB أن تُعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على BSA (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل rAlbumin. نشعر أن الابتعاد عن المنتجات التي تحتوي على مكونات حيوانية هو خطوة في الاتجاه الصحيح، ونحن قادرون على تقديم هذا التحسين بنفس السعر.