مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R0637L، MmeI

تمت إعادة صياغة إنزيم MmeI باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10263881. الفئات ذات الصلة: إنزيمات القطع المحددة HM، إنزيمات القطع المحددة الموفرة للوقت. التطبيقات: هضم إنزيم القطع. المواصفات: تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية إنزيم MmeI اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي ΦX174 RF I في ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في 50 ميكرولتر من محلول التفاعل. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 50%، NEBuffer™ r2.1: 100%، NEBuffer™ r3.1: 50%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف B، محلول التخزين : 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 300 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي مولار EDTA، 500 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، 0.32 ملي مولار S-أدينوسيل ميثيونين (SAM) 1 ملي مولار DTT، درجة الحموضة 7.4 عند 25 درجة مئوية، تعطيل حراري عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: محجوبة بالتداخل. الأسئلة الشائعة: س: هل يوجد أي تباين في مسافة القطع من موقع قطع MmeI المشار إليه بـ 20/18؟ ج: من المفيد التفكير في MmeI على أنه يضع الإندونوكلياز على مسافة ثابتة (نسبيًا) من موقع التعرف، بدلاً من أن يقوم الإنزيم بحساب القواعد بين موقع التعرف وموضع القطع. الملاحظة هي أن MmeI يقطع بشكل أساسي عند 20/18 و21/19، بنسبة تقريبية 60%/40%. يوجد أيضًا قطع طفيف عند 19/17 (بضعة بالمائة تقريبًا). يمكن قطع المواقع الفردية على مسافة واحدة في الغالب، أو على مسافات متفاوتة (20/18 و21/19)؛ ونعتقد أن هذا يعتمد على بنية الحمض النووي بين موقع التعرف وموقع القطع. س: ألاحظ هضمًا جزئيًا عند استخدام إنزيم MmeI. ما السبب المحتمل؟ ج: هناك عدة أسباب قد تمنع إنزيم MmeI من إتمام عملية القطع: 1. إنزيم MmeI حساس للأملاح في التفاعل، وأي بقايا ملحية من تحضير الحمض النووي قد تثبط عمل الإنزيم. اختبر التفاعل على حمض نووي تجاري لتحديد ما إذا كانت هذه هي المشكلة. 2. يتطلب إنزيم MmeI وجود SAM لإتمام عملية القطع بكفاءة، وSAM مادة غير مستقرة للغاية. حاول استخدام أنبوب جديد من SAM بالإضافة إلى الحمض النووي التجاري لمعرفة ما إذا كانت هذه هي المشكلة. 3. لا يتميز إنزيم MmeI بمعدل دوران عالٍ، على عكس إنزيمات التقييد الشائعة من النوع IIP. لذلك، من المهم أن تكون نسبة جزيئات MmeI إلى عدد المواقع المراد قطعها في التفاعل 1:1. قد يكون هذا الأمر بالغ الأهمية بالنسبة لجزيئات الحمض النووي القصيرة، إذ أن ميكروغرامًا واحدًا من ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بطول 100 زوج قاعدي، والذي يحتوي على موقع MmeI واحد، يُمثل ما يقارب عشرة أضعاف عدد المواقع لكل ميكروغرام مقارنةً بركيزة PhiX174 المستخدمة لتحديد وحدة MmeI. 4. يتطلب إنزيم MmeI موقعي ارتباط لإتمام عملية القطع بكفاءة، ويؤدي هضم البلازميدات التي تحتوي على موقع واحد إلى هضم جزئي بنسبة 70% تقريبًا. ولأن MmeI يتطلب موقعين، فإن إضافة أوليغونوكليوتيد مزدوج السلسلة يحتوي على موقع MmeI قد يُحسّن من كفاءة القطع. يجب أن يحتوي الأوليغونوكليوتيد المزدوج السلسلة على 8 إلى 12 زوجًا قاعديًا من التسلسل المُحيط على جانبي تسلسل التعرف على MmeI، ولكن ليس من الضروري أن يمتد حتى نقطة القطع. س: هل إنزيم MmeI حساس لمثيلة CpG؟ ج: يُحجب إنزيم MmeI بتداخل مثيلة CpG إذا تبعت قاعدة السيتوزين الوسطى، أو قاعدة السيتوزين في الطرف 3'، قاعدة غوانين، مما يؤدي إلى مثيلة CpG للسيتوزين. على سبيل المثال، لن يقطع إنزيم MmeI التسلسل TCCGAC، أو التسلسل TCCRACG، إذا أدى تعديل CpG إلى مثيلة بقايا السيتوزين التي تحتها خط. للحصول على معلومات محدثة حول حساسية المثيلة، يُرجى زيارة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: لماذا يمكن إعادة ربط موقع MmeI المقطوع ولكن لا يمكن إعادة قطعه؟ ج: إنزيم MmeI إنزيم غير عادي لأنه يمتلك خصائص التقييد والمثيلة. ولأن قطع الحمض النووي لا يكسر موقع التعرف، يمكن للإنزيم مثيلة موقع التعرف الخاص به بعد القطع. بمجرد مثيلة الموقع، لا يمكن قطعه لاحقًا بعد الربط. س: هل قطع MmeI دقيق أم أن التباعد متغير؟ ج: يقطع إنزيم MmeI في الغالب عند 20/18، ولكنه قد يقطع أحيانًا قاعدة واحدة أبعد أو أقرب إلى موقع التعرف عند 21/19 أو 19/17. س: هل يجب عليّ تحضير عمليات الهضم باستخدام إنزيمات Time-Saver™ لمدة 5-15 دقيقة؟ هل يمكنني الهضم لفترة أطول؟ ج: تتميز إنزيمات Time-Saver™ من NEB بسرعة عملها (5-15 دقيقة)، كما أنها مصممة ومؤهلة لتحمل عمليات الهضم طوال الليل دون إتلاف الحمض النووي. س: اختبرت إنزيم التقييد الخاص بكم على الحمض النووي الركيزة الموصى به من NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي تؤثر على نشاط الإنزيم. قد تُثبط الأملاح الموجودة في التفاعل إنزيمات التقييد النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات الملوحة العالية). قد تؤدي إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي إلى محاليل حمض نووي تحتوي على مستويات عالية من الأملاح، والتي قد تنتقل إلى التفاعل وتثبط نشاط الإنزيم. ولمنع ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المضاف إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. ويمكن تحقيق ذلك بتعديل إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: هل يُحسّن التحضين طوال الليل من عملية الهضم؟ ج: لا يحتاج إنزيم MmeI إلى التحضين طوال الليل، إذ يحدث الانقسام الكامل في غضون 15 دقيقة. وعادةً ما لا يُفيد التحضين لفترات طويلة في تحقيق قطع كامل، لأن الإنزيم قد يُضيف مجموعة ميثيل إلى موقعه بمرور الوقت، مما يمنع الانقسام. س: هل يتطلب إنزيم MmeI وجود SAM للنشاط؟ ج: نعم، S-أدينوسيل ميثيونين (SAM) ضروري للنشاط الأمثل (يُضاف SAM إلى تركيبة الإنزيم اعتبارًا من أكتوبر 2020). إذا لم تكن متأكدًا مما إذا كان SAM موجودًا في تركيبة الإنزيم، ولديك قارورة من SAM من NEB، فلا بأس من إضافة SAM إلى التفاعل وفقًا للإرشادات السابقة. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من BSA إلى الألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على BSA (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المؤتلف (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل rAlbumin. ونعتقد أن الابتعاد عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر.