مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R0655L، PciI

تمت إعادة صياغة PciI باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10161946. الفئات ذات الصلة: إنزيمات القطع المحددة، تطبيقات PR، مواصفات هضم إنزيمات القطع، تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من حمض pXba DNA في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: حضانة محلول NEBuffer™ r3.1 بتركيز 1X عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. محلول NEBuffer™ r3.1 بتركيز 1X، 100 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 50 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer : NEBuffer™ r1.1: 50%، NEBuffer™ r2.1: 75%، NEBuffer™ r3.1: 100%، محلول rCutSmart™: 50%. توافق المخفف : محلول التخزين (المخفف B): 10 ملي مولار Tris-HCl، 300 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 500 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. تسخين تعطيل الإنزيم عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: غير حساسة. الأسئلة الشائعة : س: كيف يمكنني البحث عن إنزيم تقييد باستخدام التسلسل أو الطرف البارز أو الاسم؟ ج: يمكنك استخدام أداة البحث عن الإنزيمات، وهي أداة جديدة متوفرة على موقعنا الإلكتروني في الشريط الجانبي ضمن "الأدوات المفضلة"، للبحث عن إنزيمات التقييد باستخدام الاسم أو التسلسل أو الطرف البارز أو النوع. تتضمن إنزيمات NEB أيقونات لخصائص الإنزيم وتُعرض كرابط. س: كيف أوقف عملية هضم الحمض النووي باستخدام إنزيم التقييد؟ ج: إذا لم تكن هناك أي عمليات أخرى مُخطط لها على الحمض النووي المهضوم، فيمكن إنهاء التفاعل بإضافة محلول إيقاف. في NEB، نستخدم محلول الإيقاف التالي: 50% جلسرين، 50 ملي مولار EDTA (الأس الهيدروجيني 8.0)، و0.05% أزرق بروموفينول (10 ميكرولتر / 50 ميكرولتر حجم التفاعل). إذا لزم إجراء المزيد من التعديلات على الحمض النووي المهضوم، فإن التثبيط الحراري (رفع درجة الحرارة إلى 65 أو 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة) هو أبسط طريقة لإيقاف التفاعل. ولأن هذه الطريقة لا تُجدي مع جميع إنزيمات القطع، يُرجى الرجوع إلى معلومات الكتالوج الخاصة بالإنزيمات التي تستخدمها. يُعد استخلاص الفينول/الكلوروفورم وسيلة أخرى لتثبيط إنزيم القطع. س: ما مدى استقرار إنزيم قطع معين؟ ج: تُفحص جميع الإنزيمات للتأكد من نشاطها كل 3-6 أشهر؛ ويُذكر تاريخ أحدث فحص على الملصق المرفق بكل قارورة من الإنزيم. بعد ثلاثين عامًا من الخبرة في مجال إنزيمات القطع، وجدنا أن معظمها يتمتع بثبات عالٍ عند تخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية في محلول التخزين الموصى به. يجب تقليل التعرض لدرجات حرارة أعلى من -20 درجة مئوية قدر الإمكان. س: متى يجب عليّ اختيار نسخة HF من الإنزيم؟ ج: يتمتع إنزيم HF بنفس خصوصية القطع التي يتمتع بها الإنزيم الأصلي، ويُنصح باختياره إذا كان النشاط النجمي مصدر قلق، أو إذا كان المحلول المنظم الموصى به أكثر ملاءمةً للهضم المزدوج أو أي بروتوكول متعدد الخطوات. لا توجد أي عيوب لاستخدام إنزيم HF. س: متى يُصبح النشاط النجمي مصدر قلق؟ ج: يُصبح النشاط النجمي مصدر قلق إذا كان ظهور نطاقات إضافية قد يُؤدي إلى سوء تفسير النتائج في إجراءات تحديد النمط الجيني وتحليل الطفرات. قد يُؤدي تصميم التجربة إلى زيادة النشاط النجمي. من المرجح أن تحتوي أحجام التفاعل الصغيرة على تركيزات من الجلسرين تبلغ 5% أو أكثر، وهي حالة معروفة بزيادة النشاط النجمي. يحدث تركيز 5% من الجلسرين عند إجراء هضم مزدوج في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر باستخدام 1 ميكرولتر من كل إنزيم. من المرجح أن تُؤدي عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة إلى توليد النشاط النجمي. للحصول على نصائح حول تجنب النشاط النجمي، يُرجى النقر هنا. س: كيف يُمكنني إعداد عملية هضم التقييد؟ ج: يتبع معظم الباحثين القاعدة العامة التي تنص على أن 10 وحدات من إنزيم القطع المحدد كافية للتغلب على التباين في مصدر الحمض النووي وكميته ونقائه. عادةً، يُضاف 1 ميكرولتر من الإنزيم إلى 1 ميكروغرام من الحمض النووي النقي في حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر من محلول NEBuffer المناسب بتركيز 1X، ثم يُحضن المزيج لمدة ساعة واحدة عند درجة الحرارة الموصى بها. في حال استخدام كمية زائدة من الإنزيم، يمكن غالبًا تقليل مدة التحضين لتوفير الوقت. بدلاً من ذلك، يمكن إجراء عملية الهضم بكفاءة باستخدام عدد أقل من وحدات الإنزيم لمدة تصل إلى 16 ساعة مع العديد من إنزيمات القطع. للحفاظ على تركيز الجلسرين أقل من 5% في التفاعل، يجب ألا تتجاوز كمية إنزيم القطع، المُقدم في محلول جلسرين بتركيز 50%، 10% من إجمالي حجم التفاعل. يُعد الخلط عنصرًا بالغ الأهمية، ولكنه غالبًا ما يُغفل عنه، في عملية الهضم الناجحة باستخدام إنزيمات القطع. يجب خلط مكونات التفاعل جيدًا لإتمام عملية الهضم. نوصي بسحب خليط التفاعل برفق باستخدام ماصة أو بتحريك أنبوب التفاعل برفق. ثم قم بتدويره سريعًا (باللمس) في جهاز طرد مركزي صغير. تجنب استخدام جهاز الخلط الدوامي. س: لا أرى أي انقسام بعد هضم الحمض النووي باستخدام إنزيمات القطع. ما العوامل التي قد تعيق عملية الانقسام؟ ج: يجب أن يكون تحضير الحمض النووي المراد قطعه خاليًا من الملوثات مثل الفينول، والكلوروفورم، والكحول، وEDTA، والمنظفات، أو الأملاح الزائدة، حيث يمكن أن تعيق جميعها نشاط إنزيمات القطع. يُعد مثيلة الحمض النووي أيضًا عنصرًا مهمًا في عملية الهضم باستخدام إنزيمات القطع. إذا كنت تواجه صعوبة في قطع ركيزة الحمض النووي، نوصي بإجراء تفاعلات التحكم التالية: حضن الحمض النووي التجريبي بدون إنزيم القطع (يشير تحلل الحمض النووي إلى وجود تلوث في تحضير الحمض النووي أو محلول التفاعل) وحمض نووي تحكم (حمض نووي يحتوي على مواقع متعددة معروفة للإنزيم، مثل حمض نووي لامدا أو أدينوفيروس-2) مع إنزيم القطع لتقييم اكتمال التفاعل بدقة أكبر. إذا تم قطع الحمض النووي المرجعي، بينما قاوم الحمض النووي التجريبي القطع، فيمكن مزج الحمضين النوويين لتحديد ما إذا كان هناك مثبط موجود في العينة التجريبية. في حال وجود مثبط (غالبًا ما يكون ملحًا أو EDTA أو فينول)، فلن يتم قطع الحمض النووي المرجعي بعد المزج. س: كيف يمكنني إنشاء خريطة مواقع إنزيمات القطع لتسلسلي؟ ج: يتوفر برنامج NEBcutter®، وهو برنامج حاسوبي لرسم خرائط مواقع إنزيمات القطع، على موقع NEB الإلكتروني في الشريط الجانبي ضمن "الأدوات المفضلة". يقبل البرنامج التسلسلات المسترجعة من ملف محلي أو من GenBank. كما يقبل أيضًا تسلسلًا مُدخلًا يتم لصقه في حقل مُخصص. عند إدخال تسلسل، سيجد NEBcutter أكبر إطارات القراءة المفتوحة داخل التسلسل، ويُشير إلى إنزيمات القطع التي يُمكن استخدامها لاستئصال الجين. كما يُحدد مواقع جميع إنزيمات القطع التي تقطع مرة واحدة فقط داخل التسلسل المُختار. يُدرك برنامج NEBcutter تمامًا المعلومات المتعلقة بحساسية إنزيمات التقييد للمثيلة، وينبه المستخدم إلى تداخل المثيلة بواسطة إنزيمات مثل dam وdcm وغيرها. س: ما المعلومات المتوفرة في قاعدة بيانات إنزيمات التقييد (REBASE)؟ ج: قاعدة بيانات إنزيمات التقييد (REBASE)، الموجودة في الشريط الجانبي ضمن "الأدوات المفضلة" على موقعنا الإلكتروني، هي قاعدة بيانات شاملة تحتوي على معلومات حول إنزيمات التقييد والبروتينات ذات الصلة. تتضمن مراجع منشورة وغير منشورة، ومواقع التعرف والقطع، والمتماثلات، والتوافر التجاري، وحساسية المثيلة، وبيانات البلورات والتسلسل. كما تشمل أيضًا ناقلات مثيل الحمض النووي، والإنزيمات الداخلية الموجهة، وإنزيمات القطع، ووحدات التخصص، وبروتينات التحكم. ومؤخرًا، أُضيفت ناقلات مثيل الحمض النووي وإنزيمات التقييد المُحتملة، كما تم التنبؤ بها من تحليل التسلسلات الجينومية. س: هل يُنصح بالهضم المطول (فترات حضانة تزيد عن ساعة واحدة)؟ ج: يعتمد تعريف وحدة إنزيمات القطع لدينا على فترة حضانة مدتها ساعة واحدة. يمكن تقصير فترة الحضانة بإضافة وحدات إضافية من إنزيم القطع إلى التفاعل. في المقابل، تُستخدم فترات حضانة أطول غالبًا للسماح للتفاعل بالاكتمال باستخدام عدد أقل من وحدات الإنزيم. يعتمد هذا على مدة بقاء الإنزيم (الحفاظ على نشاطه) في التفاعل. بعض الإنزيمات تبقى حية لفترات طويلة (أكثر من 16 ساعة)، بينما يبقى البعض الآخر حيًا لمدة ساعة أو أقل فقط. لكل إنزيم قطع، نُبلغ عن الحد الأدنى لعدد الوحدات (1.0، 0.5، 0.25، أو 0.13) اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) خلال 16 ساعة. يمكن استخدام الإنزيمات التي تتطلب أقل من وحدة واحدة بتراكيز أقل لفترات حضانة ممتدة. تجدر الإشارة إلى أن ركائز الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) تُهضم بمعدلات متفاوتة، وبالتالي فإن العدد الفعلي للوحدات اللازمة للهضم الكامل يختلف من ركيزة إلى أخرى. تحقق من معلومات كل إنزيم تقييد على حدة قبل تمديد أوقات التفاعل، حيث يجب استخدام الإنزيمات التي تُظهر نشاطًا غير نمطي في ظل الظروف الموصى بها لمنع الانقسام غير التقليدي. س: هل يجب أن تكون مواقع التعرف المتغيرة متناظرة؟ ج: معظم مواقع التعرف لإنزيمات التقييد متناظرة وتتضمن أزواج قواعد محددة فقط (مثلًا، EcoRI يتعرف على GAATTC). مع ذلك، تحتوي بعض الإنزيمات على مواقع متغيرة، أي أنها تحتوي على زوج قاعدة واحد أو أكثر غير محدد بدقة (مثلًا، BsrFI-v2 يتعرف على RCCGGY، حيث R = A أو G و Y = C أو T). بالنسبة للإنزيمات المتغيرة، يمكن أن توجد أي قاعدة ممثلة بالرمز المكون من حرف واحد في أي من موقعي التعرف لحدوث الانقسام. على سبيل المثال، يتعرف BsrFI-v2 على جميع التسلسلات التالية: ACCGGC، ACCGGT، GCCGGC، GCCGGT. س: ما معنى أن يكون الإنزيم مؤهلًا لبرنامج Time-Saver™؟ ج: تقوم الإنزيمات المؤهلة لتوفير الوقت بهضم ركيزة الاختبار في غضون 5-15 دقيقة في ظل ظروف التفاعل الموصى بها، ويمكن استخدامها بأمان أيضًا في عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة. س: ما هي إنزيمات التقييد من NEB التي تأتي مزودة بصبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X)؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF ومعظم إنزيمات التقييد غير HF من NEB تأتي مزودة بصبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X). الإنزيمات المقيدة غير HF التي تأتي مع الصبغة الأرجوانية هي: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI Sali XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * يتم أيضًا توفير جميع إنزيمات تقييد HF مع تحميل الجل صبغ، بنفسجي (6X) س: هل هذا هل هذا الإنزيم حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: لا. هذا الإنزيم غير حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات. للحصول على أحدث المعلومات حول حساسية المثيلة، يُرجى زيارة صفحة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من BSA إلى الألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ NEB أن تُعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على BSA (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل rAlbumin. نرى أن التخلي عن المنتجات التي تحتوي على مكونات حيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر. س: هل يمكن تخزين صبغة التحميل الجل، بنفسجي 6X (B7024) في درجات حرارة منخفضة؟ ج: درجة حرارة التخزين الموصى بها لصبغة التحميل الجل، بنفسجي 6X، هي درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). عادةً، قد يترسب SDS من المحلول عند تخزين الصبغة في درجات حرارة منخفضة. يمكن التخلص من هذا الترسب الطفيف بترك القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة، أو تسخينها برفق لمدة 10 دقائق. رجّ القارورة عدة مرات قبل الاستخدام لإعادة المحلول إلى حالته المتجانسة.