مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R0685S، AleI-v2

يحل هذا الإنزيم محل AleI ( الفئات ذات الصلة : إنزيمات القطع المحددة: التطبيقات : تحضير الحمض النووي، هضم الحمض النووي باستخدام إنزيمات القطع، مواصفات هضم الحمض النووي باستخدام إنزيمات القطع، تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية، محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار من أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار من أسيتات التريس، 10 ملي مولار من أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل من الألبومين المؤتلف (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer ™: NEBuffer™ r1.1: <10%، NEBuffer™ r2.1: <10% r3.1: <10% محلول rCutSmart™: توافق المخفف 100% محلول التخزين المخفف B: 10 ملي مولار Tris-HCl، 200 ملي مولار NaCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، درجة الحموضة 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: تتأثر بالتداخل. الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين AleI (NEB #R0634) وAleI-v2 (NEB #R0685)؟ ج: AleI-v2 يحل محل AleI. إنه إنزيم أكثر قوة، تم هندسته بطفرة لتحسين استقراره عند -20 درجة مئوية. يمكن تعطيل إنزيم AleI-v2 بالحرارة عند درجة حرارة أقل من إنزيم AleI. س: متى يُصبح النشاط النجمي مصدر قلق؟ ج: يُصبح النشاط النجمي مصدر قلق إذا كان ظهور نطاقات إضافية قد يُؤدي إلى سوء تفسير النتائج في إجراءات تحديد النمط الجيني وتحليل الطفرات. قد يُؤدي تصميم التجربة إلى زيادة النشاط النجمي. من المرجح أن تحتوي أحجام التفاعل الصغيرة على تركيزات من الجلسرين بنسبة 5% أو أكثر، وهي حالة معروفة بزيادة النشاط النجمي. يحدث تركيز جلسرين بنسبة 5% عند إجراء هضم مزدوج في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر باستخدام 1 ميكرولتر من كل إنزيم. من المرجح أن تُؤدي عمليات الهضم التي تستمر طوال الليل إلى توليد النشاط النجمي. للحصول على نصائح حول تجنب النشاط النجمي، يُرجى النقر هنا. س: اختبرتُ إنزيم التقييد الخاص بكم على الحمض النووي الركيزة الموصى به من قِبل NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي يُمكن أن تُؤثر على نشاط الإنزيم. إنزيمات التقييد نشطة في محلول rCutSmart®، ولكن ليس بنفس فعالية إنزيمات التقييد الأخرى. قد تُثبَّط الإنزيمات النشطة في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات التركيز الملحي العالي) بفعل الملح في التفاعل. قد تُنتج إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الملح، والتي قد تنتقل إلى التفاعل وتُثبِّط نشاط الإنزيم. ولمنع ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المُضاف إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. ويمكن تحقيق ذلك بتعديل إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: ما هي إنزيمات التقييد من NEB المُزوَّدة بصبغة تحميل الجل البنفسجية (6X)؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF ومعظم إنزيمات التقييد غير HF من NEB مُزوَّدة بصبغة تحميل الجل البنفسجية (6X). إنزيمات التقييد غير HF المُزوَّدة بصبغة بنفسجية هي: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * جميع إنزيمات التقييد HF مزودة أيضًا بصبغة تحميل الجل، بنفسجي (6X) س: هل يجب أن تكون مواقع التعرف المتغيرة متناظرة؟ ج: معظم مواقع التعرف لإنزيمات التقييد متناظرة وتتضمن أزواج قواعد محددة فقط (أي، EcoRI يتعرف على GAATTC). ومع ذلك، تحتوي بعض الإنزيمات على مواقع متغيرة، مما يعني أنها تحتوي على زوج قاعدة واحد أو أكثر غير محدد بشكل خاص (أي، يتعرف إنزيم BsrFI-v2 على التسلسل RCCGGY (حيث R = A أو G و Y = C أو T). بالنسبة للإنزيمات المتغيرة، يمكن أن تتواجد أي قاعدة ممثلة بالرمز المكون من حرف واحد في أي من موقعي التعرف لحدوث القطع. على سبيل المثال، يتعرف BsrFI-v2 على جميع التسلسلات التالية: ACCGGC، ACCGGT، GCCGGC، GCCGGT. س: هل هذا الإنزيم حساس لـ Dam أو Dcm أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: نعم. لا يستطيع هذا الإنزيم قطع مواقع التعرف في الحمض النووي الجينومي للثدييات التي تتأثر بمثيلة CpG المتداخلة. للحصول على معلومات محدثة حول حساسية المثيلة، يرجى زيارة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من BSA إلى الألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسر شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على BSA (NEBuffer) نُجري حاليًا تعديلات على محاليلنا (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1، وCutSmart® Buffer) لتشمل محاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1، وrCutSmart™ Buffer). كما نعمل على تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونعتقد أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونُقدم هذا التحسين بنفس السعر. س: هل صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) أو صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) الخالية من SDS متوافقة مع أصباغ ربط الحمض النووي الأخرى مثل SYBR® وGelRed™ أثناء الفصل الكهربائي الهلامي؟ ج: نظرًا لأن أصباغ ربط الأحماض النووية عالية الألفة قد تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُوصى بشدة بتلوين الهلام بصبغات SYBR أو GelRed بعد الفصل. مع ذلك، يُمكن استخدام هذه الأصباغ أيضًا كأصباغ مُسبقة الصب (في هلام الأغاروز). يحتوي صبغ تحميل الجل البنفسجي (6X) على تركيز أعلى في SDS، وقد يُلاحظ بعض التداخل عند استخدام SYBR أو GelRed كصبغات مُسبقة الصب. عند استخدام هذه الصبغات كصبغات مُسبقة الصب، توصي NEB باستخدام صبغ تحميل الجل البنفسجي الخالي من SDS (6X) (NEB #B7025S) بدلاً منه. يُرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام صبغات SYBR كصبغات مُسبقة الصب: قلل كمية الحمض النووي المُحمّل من العينة إلى 250 إلى 500 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من صبغات SYBR في الجل المُسبق الصب. هذه الصبغات أكثر حساسية بكثير من بروميد الإيثيديوم. قد يتسبب التحميل الزائد في ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. في حال استخدام صبغ تحميل الجل البنفسجي (6X) B7024S، استخدم محلول TBE بدلاً من محلول TAE، حيث يزداد تداخل SDS عند استخدام محلول TAE (في الجل وكسائل تشغيل). استخدم صبغات SYBR وفقًا لتوصيات الشركة المُصنّعة: أضف أضف صبغة SYBR إلى محلول TBE أولاً، ثم أضف مزيج صبغة SYBR/TBE إلى محلول الأغاروز المنصهر. يُفضل الانتظار بضع دقائق قبل إضافة صبغة SYBR إلى الأغاروز المنصهر. تُعطي إضافتها إلى محلول أغاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) نتائج أفضل. قم دائمًا بتشغيل هلام أغاروز مُحضر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج رديئة. يُرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام صبغات GelRed كصبغات مُسبقة الصب: قلل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 60 إلى 125 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من صبغة GelRed في الهلامات مُسبقة الصب. هذه الصبغة أكثر حساسية من EtBr. قد يتسبب التحميل الزائد في ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. يُفضل الانتظار بضع دقائق قبل إضافة صبغة GelRed إلى الأغاروز المنصهر. إضافتها إلى محلول أغاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) تُعطي درجة حرارة التصلب (45 درجة مئوية) نتائج أفضل. يُنصح دائمًا بتشغيل هلام الأغاروز المُحضّر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج غير مرضية. SYBR® علامة تجارية مسجلة لشركة Life Technologies Corporation، وGelRed™ علامة تجارية لشركة Biotium.