مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R0703L، BtgZI

تعرف على دقة الليغاز وتجاوز حدود الفئات ذات الصلة. تطبيقات إنزيمات القطع المحددة B. حلول الاستنساخ عالية الإنتاجية والأتمتة. مواصفات هضم إنزيم القطع. تعريف الوحدة: تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند 60 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 60 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 10%، NEBuffer™ r2.1: 25%، NEBuffer™ r3.1: أقل من 10%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف A، محلول التخزين : 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 50 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 1 ملي مولار داي ثيو ثريتول، 0.1 ملي مولار إيديتات ثنائي الصوديوم، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مصل البقر، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية ، يُسخن. تعطيل الإنزيم عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة Dam: غير حساسة، مثيلة Dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: ضعيفة. النشاط عند درجة حرارة 37 درجة مئوية: 50%. الأسئلة الشائعة : س: ما هو نشاط BtgZI عند 37 درجة مئوية؟ ج: يتمتع BtgZI بنشاط 75% عند 37 درجة مئوية. س: هل تُحجب مثيلة BtgZI نشاطه؟ ج: تُحجب مثيلة CpG عملية قطع الحمض النووي الجينومي للثدييات. للحصول على أحدث المعلومات حول حساسية المثيلة، يُرجى زيارة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: لماذا تظهر حزم الحمض النووي مشوهة عند فصلها على هلام الأغاروز؟ ج: قد يبقى BtgZI مرتبطًا بالحمض النووي بعد القطع، مما قد يُغير معدل هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي. لتعطيل الارتباط، أضف SDS بتركيز نهائي 0.5% أو نقِّ الحمض النووي قبل الفصل الكهربائي. س: اختبرتُ إنزيم القطع الخاص بكم على الحمض النووي الركيزة الموصى به من NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي تؤثر على نشاط الإنزيم. قد تُثبَّط إنزيمات القطع النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات الملوحة العالية)، بسبب وجود الملح في التفاعل. قد تُؤدي إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي إلى محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الملح، والتي قد تنتقل إلى التفاعل وتُثبِّط نشاط الإنزيم. لمنع ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المُضاف إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. يُمكن تحقيق ذلك عن طريق تعديل إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: ما هي إنزيمات القطع المستخدمة في تجميع GoldenBraid؟ أ: يُعدّ إنزيم BsaI أحد إنزيمات النوع IIS المستخدمة في هذه الطريقة. كما تُقدّم شركة NEB نسخة مُهندسة عالية الدقة من هذا الإنزيم، BsaI-HF®v2، والتي تتميّز بميزة إضافية وهي كونها مُؤهّلة لتوفير الوقت (حيث يُمكنها هضم الحمض النووي DNA في غضون 5-15 دقيقة، ويمكن هضمها بأمان طوال الليل)، وتُظهر نشاطًا نجميًا مُنخفضًا. يعمل إنزيم BsaI-HFv2 في محلول CutSmart®، كما هو الحال مع إنزيم T4 DNA Ligase (وهو أيضًا جزء من سير عمل GoldenBraid)، والذي يكون نشطًا وظيفيًا بنسبة 100% في هذا المحلول، عند إضافة 1 ملي مول من ATP إلى التفاعل. تشمل إنزيمات النوع IIS الأخرى المُستخدمة في GoldenBraid: BsmBI-v2/Esp3I، وBtgZI، وBbsI/BbsI-HF، وPaqCI (نظير AarI مع تسلسل تعرّف بطول 7 أزواج قاعدية). المرجع: GoldenBraid 2.0: إطار عمل شامل لتجميع الحمض النووي في البيولوجيا التركيبية النباتية. س: ما هي إنزيمات التقييد المستخدمة في تجميع Golden Gate؟ ج: تجميع Golden Gate هو طريقة استنساخ فعالة أحادية الأنبوب تعتمد على إنزيمات التقييد من النوع IIS التي تقطع خارج مواقع التعرف الخاصة بها وتترك نهايات بارزة من 3 أو 4 قواعد. يُعد BsaI أكثر إنزيمات النوع IIS استخدامًا في تجميع Golden Gate. كما تُقدم NEB نسخة مُهندسة عالية الدقة من هذا الإنزيم، BsaI-HF®v2، والتي تتميز بميزة إضافية وهي كونها مُؤهلة لتوفير الوقت (حيث يمكنها هضم الحمض النووي في غضون 5-15 دقيقة أو طوال الليل دون تحلله) وتُظهر نشاطًا نجميًا مُنخفضًا بشكل كبير. تشمل إنزيمات النوع IIS الأخرى المستخدمة في تجميع Golden Gate كلاً من BsmBI-v2/Esp3I وBbsI/BbsI-HF وPaqCI (نظير AarI ذو تسلسل تعرف مكون من 7 أزواج قاعدية) وSapI/BspQI/BspQI-HF (ذو تسلسل تعرف مكون من 7 أزواج قاعدية وبروزات مكونة من 3 أزواج قاعدية). س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من الألبومين البقري المصل (BSA) إلى الألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسر شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري المصل (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المؤتلف (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المؤتلف. نشعر أن الابتعاد عن المنتجات التي تحتوي على مكونات حيوانية هو خطوة في الاتجاه الصحيح، ونحن قادرون على تقديم هذا التحسين بنفس السعر.