نيو إنجلاند بيولابس، R0709S، TspMI

الفئات ذات الصلة: إنزيمات القطع المحددة TZ، تطبيقات إنزيمات القطع المحددة المؤهلة لتوفير الوقت: الاستنساخ السريع: تسريع عمليات الاستنساخ الخاصة بك باستخدام الكواشف من NEB، مواصفات هضم إنزيم القطع : تعريف الوحدة: تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي pBC4 في ساعة واحدة عند 75 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 75 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 50%، NEBuffer™ r2.1: 75%، NEBuffer™ r3.1: 50%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف B، محلول التخزين : 20 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 300 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار داي ثيو ثريتول، 1 ملي مولار إيديتات ثنائي الصوديوم، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مصل البقر، 50% جلسرين، 0.1% تريتون® X-100، الأس الهيدروجيني 8 عند 25 درجة مئوية ، تعطيل حراري ، لا حساسية للمثيلة، مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: مُثبَّطة، النشاط عند درجة حرارة 37 درجة مئوية: 10% ، الأسئلة الشائعة: س: كيف يمكنني البحث عن إنزيم تقييد حسب التسلسل أو الطرف البارز أو الاسم؟ ج: يمكن استخدام أداة البحث عن الإنزيم، وهي أداة جديدة متوفرة على موقعنا الإلكتروني في الشريط الجانبي ضمن "الأدوات المفضلة"، للبحث عن إنزيمات التقييد حسب الاسم أو التسلسل أو الطرف البارز أو النوع. تتضمن إنزيمات NEB أيقونات خصائص الإنزيم وتُعرض كرابط. س: كيف أوقف عملية هضم التقييد؟ ج: إذا لم تكن هناك أي معالجات أخرى مُخطط لها للحمض النووي المهضوم، فيمكن إنهاء التفاعل بإضافة محلول إيقاف. في شركة NEB، نستخدم محلول الإيقاف التالي: 50% جلسرين، 50 ملي مولار EDTA (الأس الهيدروجيني 8.0)، و0.05% بروموفينول أزرق (10 ميكرولتر / 50 ميكرولتر حجم التفاعل). إذا لزم إجراء المزيد من التعديلات على الحمض النووي المهضوم، فإن التثبيط الحراري (رفع درجة الحرارة إلى 65 أو 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة) هو أبسط طريقة لإيقاف التفاعل. ولأن هذه الطريقة لا تُجدي مع جميع إنزيمات القطع، يُرجى الرجوع إلى معلومات الكتالوج الخاصة بالإنزيمات المستخدمة. يُعد استخلاص الفينول/الكلوروفورم وسيلة أخرى لتثبيط إنزيم القطع. س: ما مدى استقرار إنزيم قطع معين؟ ج: تُفحص جميع الإنزيمات للتأكد من نشاطها كل 3-6 أشهر؛ ويُذكر تاريخ أحدث فحص على الملصق المرفق بكل قارورة من الإنزيم. بعد ثلاثين عامًا من الخبرة مع إنزيمات القطع، وجدنا أن معظمها يتمتع بثبات عالٍ عند تخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية في محلول التخزين الموصى به. يجب تقليل التعرض لدرجات حرارة أعلى من -20 درجة مئوية قدر الإمكان. س: متى يُصبح النشاط النجمي مصدر قلق؟ ج: يُصبح النشاط النجمي مصدر قلق إذا كان ظهور نطاقات إضافية قد يُؤدي إلى سوء تفسير النتائج في إجراءات تحديد النمط الجيني وتحليل الطفرات. قد يُؤدي تصميم التجربة إلى زيادة النشاط النجمي. من المرجح أن تحتوي أحجام التفاعل الصغيرة على تركيزات من الجلسرين تبلغ 5% أو أكثر، وهي حالة معروفة بزيادة النشاط النجمي. يحدث تركيز جلسرين بنسبة 5% عند إجراء هضم مزدوج في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر باستخدام 1 ميكرولتر من كل إنزيم. من المرجح أن تُؤدي عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة إلى ظهور النشاط النجمي. للحصول على نصائح حول تجنب النشاط النجمي، يُرجى النقر هنا. س: كيف يُمكنني إعداد عملية هضم باستخدام إنزيمات القطع؟ ج: يتبع معظم الباحثين القاعدة العامة التي تنص على أن 10 وحدات من إنزيم القطع كافية للتغلب على التباين في مصدر الحمض النووي وكميته ونقائه. بشكل عام، يُضاف 1 ميكرولتر من الإنزيم إلى 1 ميكروغرام من الحمض النووي المُنقّى في حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر من محلول NEBuffer المناسب بتركيز 1X، ثم يُحضن المزيج لمدة ساعة واحدة عند درجة الحرارة الموصى بها. في حال استخدام كمية زائدة من الإنزيم، يمكن تقليل مدة التحضين لتوفير الوقت. بدلاً من ذلك، يُمكنك هضم الحمض النووي بكفاءة باستخدام كمية أقل من الإنزيم لمدة تصل إلى 16 ساعة مع العديد من إنزيمات القطع. للحفاظ على تركيز الجلسرين أقل من 5% في التفاعل، يجب ألا تتجاوز كمية إنزيم القطع، المُزوّد ​​في محلول جلسرين بتركيز 50%، 10% من إجمالي حجم التفاعل. يُعدّ الخلط عنصرًا بالغ الأهمية، ولكنه غالبًا ما يُغفل عنه، لضمان نجاح عملية الهضم باستخدام إنزيمات القطع. يجب خلط المزيج جيدًا لإتمام عملية الهضم. نوصي بسحب المزيج برفق باستخدام ماصة أو بتحريك أنبوب التفاعل برفق. بعد ذلك، قم بتدوير المزيج بسرعة في جهاز طرد مركزي صغير. تجنّب استخدام جهاز الخلط الدوّامي. س: لا أرى أي انقسام بعد عملية الهضم بالإنزيمات القاطعة. ما العوامل التي قد تعيق عملية الانقسام؟ ج: يجب أن يكون تحضير الحمض النووي المراد قطعه خاليًا من الملوثات مثل الفينول، والكلوروفورم، والكحول، وEDTA، والمنظفات، أو الأملاح الزائدة، حيث يمكن أن تعيق جميعها نشاط الإنزيمات القاطعة. يُعد مثيلة الحمض النووي أيضًا عنصرًا مهمًا في عملية الهضم بالإنزيمات القاطعة. إذا كنت تواجه صعوبة في قطع ركيزة الحمض النووي، فنوصي بإجراء تفاعلات التحكم التالية: حضن الحمض النووي التجريبي بدون إنزيم قاطع (يشير تحلل الحمض النووي إلى وجود تلوث في تحضير الحمض النووي أو محلول التفاعل) مع الحمض النووي الضابط (حمض نووي يحتوي على مواقع متعددة معروفة للإنزيم، مثل حمض نووي لامدا أو أدينوفيروس-2) مع الإنزيم القاطع لتقييم اكتمال التفاعل بدقة أكبر. إذا تم قطع الحمض النووي الضابط بينما قاوم الحمض النووي التجريبي القطع، فيمكن خلط الحمضين النوويين لتحديد ما إذا كان هناك مثبط موجود في العينة التجريبية. في حال وجود مثبط (غالباً ملح، أو EDTA، أو فينول)، لن يتم قطع الحمض النووي المرجعي بعد الخلط. س: كيف يمكنني إنشاء خريطة مواقع إنزيمات القطع لتسلسلي؟ ج: يتوفر برنامج NEBcutter®، وهو برنامج حاسوبي لرسم خرائط مواقع إنزيمات القطع، على موقع NEB الإلكتروني في الشريط الجانبي ضمن "الأدوات المفضلة". يقبل البرنامج التسلسلات المسترجعة من ملف محلي أو من GenBank. كما يقبل تسلسلاً مُدخلاً يتم لصقه في حقل مُخصص. عند إدخال تسلسل، سيجد NEBcutter أكبر إطارات القراءة المفتوحة داخل التسلسل، ويُشير إلى إنزيمات القطع التي يُمكن استخدامها لاستئصال الجين. كما يُحدد مواقع جميع إنزيمات القطع التي تقطع مرة واحدة فقط داخل التسلسل المُختار. يُدرك NEBcutter أيضاً معلومات حساسية إنزيمات القطع للمثيلة، ويُنبه المستخدم إلى تداخل المثيلة بواسطة dam، وdcm، وما إلى ذلك. س: ما المعلومات المتوفرة في قاعدة بيانات إنزيمات القطع (REBASE)؟ ج: قاعدة بيانات إنزيمات التقييد (REBASE)، الموجودة في الشريط الجانبي ضمن "الأدوات المفضلة" على موقعنا الإلكتروني، هي قاعدة بيانات شاملة تحتوي على معلومات حول إنزيمات التقييد والبروتينات ذات الصلة. تتضمن مراجع منشورة وغير منشورة، ومواقع التعرف والقطع، والمتماثلات، وتوافرها التجاري، وحساسيتها للمثيلة، وبيانات البلورات والتسلسل. كما تشمل أيضًا ناقلات مثيل الحمض النووي، والإنزيمات الداخلية الموجهة، وإنزيمات القطع، ووحدات التخصص، وبروتينات التحكم. ومؤخرًا، أُضيفت ناقلات مثيل الحمض النووي وإنزيمات التقييد المحتملة، كما تم التنبؤ بها من تحليل التسلسلات الجينومية. س: هل يجب أن تكون مواقع التعرف المتغيرة متناظرة؟ ج: معظم مواقع التعرف لإنزيمات التقييد متناظرة وتتضمن أزواج قواعد محددة فقط (على سبيل المثال، يتعرف EcoRI على GAATTC). مع ذلك، تحتوي بعض الإنزيمات على مواقع متغيرة، أي أنها تحتوي على زوج أو أكثر من القواعد غير المحددة بدقة (مثلًا، يتعرف إنزيم BsrFI-v2 على التسلسل RCCGGY، حيث R = A أو G و Y = C أو T). بالنسبة للإنزيمات المتغيرة، يمكن أن توجد أي قاعدة ممثلة بالرمز المكون من حرف واحد في أي من موقعي التعرف لحدوث القطع. على سبيل المثال، يتعرف إنزيم BsrFI-v2 على جميع التسلسلات التالية: ACCGGC، ACCGGT، GCCGGC، GCCGGT. س: هل يُنصح بالهضم المطول (فترات حضانة تزيد عن ساعة واحدة)؟ ج: يعتمد تعريف وحدة إنزيمات التقييد لدينا على فترة حضانة مدتها ساعة واحدة. يمكن تقصير فترة الحضانة بإضافة وحدات إضافية من إنزيم التقييد إلى التفاعل. في المقابل، غالبًا ما تُستخدم فترات حضانة أطول للسماح للتفاعل بالاكتمال باستخدام عدد أقل من وحدات الإنزيم. يعتمد هذا على المدة التي يمكن أن يبقى فيها إنزيم معين فعالًا (يحافظ على نشاطه) في التفاعل. بعض الإنزيمات تبقى حية لفترات طويلة (أكثر من 16 ساعة)، بينما لا يبقى البعض الآخر إلا ساعة واحدة أو أقل في التفاعل. لكل إنزيم تقييد، نُبلغ عن الحد الأدنى من الوحدات (1.0، 0.5، 0.25، أو 0.13) اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) خلال 16 ساعة. يمكن استخدام الإنزيمات التي تتطلب أقل من وحدة واحدة بتراكيز أقل لفترات حضانة أطول. تجدر الإشارة إلى أن ركائز الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) تُهضم بمعدلات متفاوتة، وبالتالي يختلف عدد الوحدات اللازمة للهضم الكامل من ركيزة إلى أخرى. يُرجى مراجعة معلومات كل إنزيم تقييد على حدة قبل تمديد أوقات التفاعل، حيث يجب استخدام الإنزيمات ذات النشاط النجمي (star activity) وفقًا للشروط الموصى بها لمنع الانقسام غير التقليدي. سؤال: هل يجب عليّ إعداد عمليات الهضم باستخدام إنزيمات Time-Saver™ المؤهلة لمدة 5-15 دقيقة؟ هل يمكنني الهضم لفترة أطول؟ جواب: تتميز إنزيمات Time-Saver™ من NEB بسرعة عملها (5-15 دقيقة)، كما أنها مصممة ومؤهلة لتحمل عمليات الهضم طوال الليل دون تحلل الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA). س: اختبرتُ إنزيم القطع الخاص بكم على الحمض النووي الموصى به من قِبل شركة NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي تؤثر على نشاط الإنزيم. قد تُثبَّط إنزيمات القطع النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات التركيز الملحي العالي)، بسبب وجود الملح في التفاعل. قد تُؤدي إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي إلى محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الملح، والتي قد تنتقل إلى التفاعل وتُثبِّط نشاط الإنزيم. لتجنب ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المُضافة إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. يُمكن تحقيق ذلك عن طريق تعديل إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: ما معنى أن يكون المنتج مؤهلًا لبرنامج Time-Saver™؟ ج: تقوم الإنزيمات المؤهلة لتوفير الوقت بهضم ركيزة الفحص في غضون 5-15 دقيقة في ظل ظروف التفاعل الموصى بها، ويمكن استخدامها بأمان في عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة. س: هل هذا الإنزيم حساس لـ Dam أو Dcm أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: نعم. لا يستطيع هذا الإنزيم قطع مواقع التعرف في الحمض النووي الجينومي للثدييات التي تحجبها مثيلة CpG. للحصول على معلومات محدثة حول حساسية المثيلة، يرجى زيارة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من BSA إلى الألبومين المؤتلف (rAlbumin) في NEBuffers؟ يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونرى أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر.