نيو إنجلاند بيولابس، R0725S، WarmStart® Nt.BstNBI

الفئات ذات الصلة: إنزيمات القطع الداخلي، إنزيمات التقييد الداخلي: لا، تطبيقات إنزيمات التقييد الداخلي: تضخيم إزاحة السلسلة والقطع الداخلي. مواصفات الإنزيم: تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي T7 في محلول NEBuffer r3.1 في ساعة واحدة عند 55 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: حضانة عند 55 درجة مئوية باستخدام محلول NEBuffer™ r3.1 بتركيز 1X. المكونات: 100 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 50 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). تركيز الاستخدام: 10X. النشاط في محاليل NEBuffer : NEBuffer™ r1.1: 0%، NEBuffer™ r2.1: 10%، NEBuffer™ r3.1: 100%، محلول rCutSmart™: 25%. توافق المخفف : محلول التخزين المخفف A: 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4. تعطيل حراري عند 25 درجة مئوية، ثم عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: غير حساسة. النشاط عند درجة حرارة 37 درجة مئوية: 0%. الأسئلة الشائعة : س: ما هي مزايا WarmStart® Nt.BstNBI؟ ج: يمكن استخدام WarmStart® Nt.BstNBI في التطبيقات التي يُستخدم فيها Nt.BstNBI. يعمل الأبتامر الموجود في WarmStart Nt.BstNBI على تثبيط نشاط القطع عند درجات حرارة أقل من 40 درجة مئوية، وبالتالي لا يتم تنشيط الإنزيم بالكامل إلا عند الوصول إلى درجات حرارة تفاعل تتراوح بين 50 و60 درجة مئوية. تتيح هذه الميزة تجميع المقايسات عالية الإنتاجية وإعدادها في درجة حرارة الغرفة (مثل SDA). بالإضافة إلى ذلك، نظرًا للتحكم الدقيق في نشاط الإنزيم، تكون النتائج متسقة والاختلافات بين التكرارات منخفضة. س: ما هو تضخيم إزاحة السلسلة (SDA)؟ ج: تضخيم إزاحة السلسلة هو طريقة تضخيم الحمض النووي متساوية الحرارة في المختبر، تعتمد على إنزيم قاطع لقطع أحد سلسلتي الحمض النووي المزدوج، وبوليميراز الحمض النووي ذي نقص في الإكسونوكلياز لتمديد الطرف 3' عند القطع وإزاحة سلسلة الحمض النووي التالية (جي تي ووكر، 1992). يمكن تطبيق هذه الطريقة للكشف السريع عن الحمض النووي المستهدف بحساسية عالية في بيئة الرعاية الصحية الأولية، وقد أصبحت طريقة شائعة للتشخيص الجزيئي. نعرض تفاعل تضخيم إزاحة السلسلة النموذجي باستخدام WarmStart Nt.BstNBI (NEB #R0725) وبوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 WarmStart® (NEB #M0538) للكشف عن هدف hBRCA1 في الحمض النووي الجينومي لخلايا HeLa في WarmStart Nt.BstNBI. لمعرفة المزيد والاطلاع على منتجاتنا من تفاعلات تضخيم إزاحة السلسلة وتضخيم إنزيم القطع، يرجى زيارة هذا الرابط. س: متى يُثير النشاط النجمي القلق؟ ج: يُعدّ النشاط النجمي مصدر قلق إذا كان ظهور نطاقات إضافية قد يُؤدي إلى سوء تفسير النتائج في إجراءات تحديد النمط الجيني وتحليل الطفرات. قد يُؤدي تصميم التجربة إلى زيادة النشاط النجمي. من المرجح أن تحتوي أحجام التفاعل الصغيرة على تركيزات من الجلسرين تبلغ 5% أو أكثر، وهي حالة معروفة بزيادة النشاط النجمي. يحدث تركيز جلسرين بنسبة 5% عند إجراء هضم مزدوج في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر باستخدام 1 ميكرولتر من كل إنزيم. من المرجح أن تُؤدي عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة إلى ظهور النشاط النجمي. للحصول على نصائح حول تجنب النشاط النجمي، يُرجى النقر هنا. س: ما هي إنزيمات التقييد من NEB التي تأتي مع صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X)؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF ومعظم إنزيمات التقييد غير HF من NEB تأتي مع صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X). الإنزيمات المقيدة غير HF التي تأتي مع الصبغة الأرجوانية هي: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI Sali XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * يتم أيضًا توفير جميع إنزيمات تقييد HF مع تحميل الجل صبغ، بنفسجي (6X) س: هل هو جل هل صبغة التحميل البنفسجية (6X) أو صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X)، الخالية من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)، متوافقة مع أصباغ ربط الحمض النووي الأخرى مثل SYBR® وGelRed™ أثناء عملية الفصل الكهربائي الهلامي؟ الجواب: نظرًا لأن أصباغ ربط الأحماض النووية عالية الألفة قد تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُنصح بشدة بتلوين الجل بعد الفصل الكهربائي باستخدام صبغات SYBR أو GelRed. مع ذلك، يمكن أيضًا استخدام هذه الأصباغ كأصباغ مُسبقة الصب (داخل هلام الأغاروز). ونظرًا لأن صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) تحتوي على تركيز أعلى من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)، فقد يُلاحظ بعض التداخل عند استخدام SYBR أو GelRed كأصباغ مُسبقة الصب. عند استخدام هذه الأصباغ كأصباغ مُسبقة الصب، توصي NEB باستخدام صبغة تحميل الجل البنفسجية الخالية من كبريتات دوديسيل الصوديوم (6X) (NEB #B7025S) بدلاً منها. يرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام صبغات SYBR كصبغات مُسبقة الصب: قلل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 250-500 نانوغرام، واستخدم تركيز 0.5X فقط من صبغات SYBR في الهلامات مُسبقة الصب. هذه الصبغات أكثر حساسية من بروميد الإيثيديوم. قد يؤدي التحميل الزائد إلى ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. عند استخدام صبغة تحميل الهلام، البنفسجية (6X) B7024S، استخدم محلول TBE بدلاً من محلول TAE، حيث يزداد تداخل SDS عند استخدام محلول TAE (في الهلام وكسائل تشغيل). استخدم صبغات SYBR وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة: أضف صبغة SYBR إلى محلول TBE أولاً، ثم أضف مزيج صبغة SYBR/TBE إلى محلول الأغاروز المنصهر. يُفضل الانتظار لبضع دقائق قبل إضافة صبغات SYBR إلى الأغاروز المنصهر. إضافة صبغة GelRed إلى محلول أجاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) تُحسّن النتائج. يُنصح دائمًا بتشغيل هلام أجاروز مُحضّر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج رديئة. يُرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام صبغات GelRed كصبغات مُسبقة الصب: قلّل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 60-125 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من صبغة GelRed في الهلامات مُسبقة الصب. هذه الصبغة أكثر حساسية من EtBr. قد يتسبب التحميل الزائد في ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. يُفضّل الانتظار لبضع دقائق قبل إضافة صبغة GelRed إلى الأجاروز المنصهر. إضافة صبغة GelRed إلى محلول أجاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) تُحسّن النتائج. يُنصح دائمًا بتشغيل هلام أجاروز مُحضّر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج رديئة. SYBR® هي علامة تجارية مسجلة لشركة Life Technologies Corporation، وGelRed™ هي علامة تجارية لشركة Biotium.