مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R0734L، Esp3I

تعرف على دقة الليغاز وتجاوز حدود الفئات ذات الصلة من إنزيمات القطع المحددة CG، تطبيقات إنزيمات القطع المحددة المؤهلة لتوفير الوقت، حلول الاستنساخ عالية الإنتاجية والأتمتة، تجميع البوابة الذهبية NEBridge®، الاستنساخ السريع: تسريع عمليات الاستنساخ الخاصة بك باستخدام الكواشف من NEB. تعريف الوحدة : تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار من أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار من أسيتات التريس، 10 ملي مولار من أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل من الألبومين المؤتلف (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 100%، NEBuffer™ r2.1: 100%، NEBuffer™ r3.1: أقل من 10%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف B، محلول التخزين: 10 ملي مولار من Tris-HCl، 300 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار من DTT، 0.1 ملي مولار من EDTA، 500 ميكروغرام/مل من BSA، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. تعطيل حراري عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: محجوبة. الأسئلة الشائعة : س: لماذا يوجد موقع Esp3I في LITMUS 38 وليس في LITMUS 39؟ ج: نتج موقع Esp3I في LITMUS 38 عن وجود مواقع تقييد متجاورة لإنزيمات الاستنساخ الشائعة في منطقة الربط المتعدد. س: ما هي الاختلافات بين BsmBI-v2 ونظيره المتماثل Esp3I؟ ج: BsmBI-v2 هو إنزيم تقييد من النوع IIS يتطلب حضانة عند 55 درجة مئوية ويأتي مع محلول NEBuffer r3.1. أما Esp3I فهو نظير متماثل لـ BsmBI-v2 يتطلب حضانة عند 37 درجة مئوية ويأتي مع محلول rCutSmart Buffer™ (يأتي مع rCutSmart أكثر من 210 إنزيمات تقييد). يُستخدم هذان الإنزيمان في عملية تجميع غولدن غيت. س: متى يُصبح النشاط النجمي مصدر قلق؟ ج: يُصبح النشاط النجمي مصدر قلق إذا كان ظهور نطاقات إضافية قد يُؤدي إلى سوء تفسير النتائج في إجراءات تحديد النمط الجيني وتحليل الطفرات. قد يُؤدي تصميم التجربة إلى زيادة النشاط النجمي. من المُرجح أن تحتوي أحجام التفاعل الصغيرة على تركيزات من الجلسرين بنسبة 5% أو أكثر، وهي حالة معروفة بزيادة النشاط النجمي. يحدث تركيز جلسرين بنسبة 5% عند إعداد هضم مزدوج في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر باستخدام 1 ميكرولتر من كل إنزيم. من المُرجح أن تُؤدي عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة إلى توليد النشاط النجمي. للحصول على نصائح حول تجنب النشاط النجمي، يُرجى النقر هنا. س: ماذا يعني أن يكون الإنزيم مؤهلاً لتقنية Time-Saver™؟ ج: تقوم الإنزيمات المؤهلة لتقنية Time-Saver™ بهضم ركيزة الفحص في غضون 5-15 دقيقة في ظل ظروف التفاعل المُوصى بها، ويمكن استخدامها بأمان أيضًا في عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة. س: هل يجب عليّ إعداد عمليات الهضم باستخدام الإنزيمات المؤهلة لتقنية Time-Saver™ لمدة 5-15 دقيقة؟ هل يُمكنني إجراء عملية الهضم لفترة أطول؟ ج: تتميز إنزيمات Time-Saver™ من NEB بسرعة عملها (من 5 إلى 15 دقيقة)، كما أنها مصممة ومؤهلة لتحمل عمليات الهضم طوال الليل دون إتلاف الحمض النووي. س: اختبرتُ إنزيم القطع الخاص بكم على الحمض النووي الموصى به من NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي تؤثر على نشاط الإنزيم. قد تُثبط الأملاح الموجودة في التفاعل إنزيمات القطع النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات التركيز الملحي العالي). قد تُثبط الأملاح الموجودة في التفاعل نشاط إنزيمات القطع النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات التركيز الملحي العالي). قد تؤدي إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي إلى محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الأملاح التي قد تنتقل إلى التفاعل وتُثبط نشاط الإنزيم. لتجنب ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المُضاف إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق ضبط إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: ما هي إنزيمات القطع المستخدمة في تقنية التجميع الذهبي؟ ج: تقنية التجميع الذهبي هي طريقة استنساخ فعالة أحادية الأنبوب تعتمد على إنزيمات القطع من النوع IIS التي تقطع خارج مواقع التعرف الخاصة بها وتترك نهايات بارزة بطول 3 أو 4 قواعد. يُعدّ إنزيم BsaI أكثر إنزيمات النوع IIS استخدامًا في تقنية التجميع الذهبي. كما تُقدّم شركة NEB نسخة مُهندسة عالية الدقة من هذا الإنزيم، BsaI-HF®v2، والتي تتميز بكونها مُؤهلة لتوفير الوقت (حيث يمكنها هضم الحمض النووي في غضون 5-15 دقيقة أو طوال الليل دون تحلله) وتُظهر نشاطًا نجميًا مُنخفضًا بشكل كبير. تشمل إنزيمات النوع IIS الأخرى المستخدمة في تقنية التجميع الذهبي: BsmBI-v2/Esp3I، وBbsI/BbsI-HF، وPaqCI (نظير AarI مع تسلسل تعرف بطول 7 قواعد)، وSapI/BspQI/BspQI-HF (مع تسلسل تعرف بطول 7 قواعد ونهايات بارزة بطول 3 قواعد). س: ما هي إنزيمات القطع المستخدمة في تقنية التجميع الذهبي المضفر؟ أ: يُعدّ إنزيم BsaI أحد إنزيمات النوع IIS المستخدمة في هذه الطريقة. كما تُقدّم شركة NEB نسخة مُهندسة عالية الدقة من هذا الإنزيم، BsaI-HF®v2، والتي تتميّز بميزة إضافية وهي كونها مُؤهّلة لتوفير الوقت (حيث يُمكنها هضم الحمض النووي DNA في غضون 5-15 دقيقة، ويمكن هضمها بأمان طوال الليل)، وتُظهر نشاطًا نجميًا مُنخفضًا. يعمل إنزيم BsaI-HFv2 في محلول CutSmart®، كما هو الحال مع إنزيم T4 DNA Ligase (وهو أيضًا جزء من سير عمل GoldenBraid)، والذي يكون نشطًا وظيفيًا بنسبة 100% في هذا المحلول، عند إضافة 1 ملي مول من ATP إلى التفاعل. تشمل إنزيمات النوع IIS الأخرى المُستخدمة في GoldenBraid: BsmBI-v2/Esp3I، وBtgZI، وBbsI/BbsI-HF، وPaqCI (نظير AarI مع تسلسل تعرّف بطول 7 أزواج قاعدية). المرجع: GoldenBraid 2.0: إطار عمل شامل لتجميع الحمض النووي في علم الأحياء التركيبي النباتي. س: ما هي إنزيمات التقييد NEB التي تأتي مزودة بصبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X)؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF ومعظم إنزيمات التقييد NEB غير HF تأتي مزودة بصبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X). الإنزيمات المقيدة غير HF التي تأتي مع الصبغة الأرجوانية هي: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI Sali XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * يتم أيضًا توفير جميع إنزيمات تقييد HF مع تحميل الجل صبغ، بنفسجي (6X) س: هل هذا؟ هل هذا الإنزيم حساس لـ Dam أو DCM أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: نعم. لا يستطيع هذا الإنزيم قطع مواقع التعرف في الحمض النووي الجينومي للثدييات التي تُحجب بمثيلة CpG. للحصول على أحدث المعلومات حول حساسية المثيلة، يُرجى زيارة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من الألبومين البقري (BSA) إلى الألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ NEB أن تُعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على BSA (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل rAlbumin. نرى أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر. س: هل صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) أو صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) الخالية من SDS متوافقة مع أصباغ ربط الحمض النووي الأخرى مثل SYBR® وGelRed™ أثناء الفصل الكهربائي الهلامي؟ ج: نظرًا لأن أصباغ ربط الأحماض النووية عالية الألفة قد تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُنصح بشدة بتلوين الهلام بصبغات SYBR أو GelRed بعد الفصل. مع ذلك، يمكن استخدام هذه الأصباغ كأصباغ مُسبقة الصب (في هلام الأغاروز). ولأن صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) تحتوي على تركيز أعلى من SDS، فقد يُلاحظ بعض التداخل عند استخدام SYBR أو GelRed كأصباغ مُسبقة الصب. عند استخدام هذه الأصباغ كأصباغ مُسبقة الصب، توصي NEB باستخدام صبغة تحميل الجل البنفسجية الخالية من SDS (6X) (NEB #B7025S) بدلاً منها. يرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام صبغات SYBR كصبغات مُسبقة الصب: قلل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 250-500 نانوغرام، واستخدم تركيز 0.5X فقط من صبغات SYBR في الهلامات مُسبقة الصب. هذه الصبغات أكثر حساسية من بروميد الإيثيديوم. قد يؤدي التحميل الزائد إلى ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. عند استخدام صبغة تحميل الهلام، البنفسجية (6X) B7024S، استخدم محلول TBE بدلاً من محلول TAE، حيث يزداد تداخل SDS عند استخدام محلول TAE (في الهلام وكسائل تشغيل). استخدم صبغات SYBR وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة: أضف صبغة SYBR إلى محلول TBE أولاً، ثم أضف مزيج صبغة SYBR/TBE إلى محلول الأغاروز المنصهر. يُفضل الانتظار لبضع دقائق قبل إضافة صبغات SYBR إلى الأغاروز المنصهر. إضافة صبغة GelRed إلى محلول أجاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) تُحسّن النتائج. يُنصح دائمًا بتشغيل هلام أجاروز مُحضّر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج رديئة. يُرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام صبغات GelRed كصبغات مُسبقة الصب: قلّل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 60-125 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من صبغة GelRed في الهلامات مُسبقة الصب. هذه الصبغة أكثر حساسية من EtBr. قد يتسبب التحميل الزائد في ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. يُفضّل الانتظار لبضع دقائق قبل إضافة صبغة GelRed إلى الأجاروز المنصهر. إضافة صبغة GelRed إلى محلول أجاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) تُحسّن النتائج. يُنصح دائمًا بتشغيل هلام أجاروز مُحضّر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج رديئة. SYBR® هي علامة تجارية مسجلة لشركة Life Technologies Corporation، وGelRed™ هي علامة تجارية لشركة Biotium.