مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R0739L، BsmBI-v2

تمت إعادة صياغة BsmBI-v2 باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10284618. الفئات ذات الصلة: إنزيمات القطع المحددة B، إنزيمات القطع المحددة الموفرة للوقت. التطبيقات: حلول الاستنساخ والأتمتة عالية الإنتاجية، تحضير الحمض النووي، تحليل الحمض النووي. تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند 55 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول NEBuffer™ r3.1 بتركيز 1X، يُحضن عند 55 درجة مئوية. المكونات: محلول NEBuffer™ r3.1 بتركيز 1X، 100 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 50 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). تركيز الاستخدام: 1X. النشاط في محاليل NEBuffer : NEBuffer™ r1.1: أقل من 10%، NEBuffer™ r2.1: 50%، NEBuffer™ r3.1: 100%، محلول rCutSmart™: 25%. توافق المخفف : المخفف B، محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 300 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 500 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4. تعطيل حراري عند 25 درجة مئوية، ثم عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: مُثبَّطة. النشاط عند درجة حرارة 37 درجة مئوية: 10%. الأسئلة الشائعة : س: لماذا يوجد موقع BsmBI في LITMUS 38 وليس في LITMUS 39؟ ج: نتج موقع BsmBI في LITMUS 38 عن وجود مواقع تقييد متجاورة لأنزيمات الاستنساخ الشائعة في منطقة الربط المتعدد. س: ما هي إنزيمات التقييد المستخدمة في تجميع Golden Gate؟ ج: تجميع Golden Gate هو طريقة استنساخ فعالة أحادية الأنبوب تعتمد على إنزيمات التقييد من النوع IIS التي تقطع خارج مواقع التعرف الخاصة بها وتترك نتوءات من 3 أو 4 قواعد. يُعد BsaI أكثر إنزيمات النوع IIS استخدامًا في تجميع Golden Gate. تقدم شركة NEB أيضًا نسخة مُهندسة عالية الدقة من هذا الإنزيم، BsaI-HF®v2، والتي تتميز بميزة إضافية وهي كونها مُؤهلة لتوفير الوقت (حيث يمكنها هضم الحمض النووي في غضون 5-15 دقيقة أو طوال الليل دون إتلافه) وتُظهر نشاطًا نجميًا مُنخفضًا بشكل ملحوظ. تشمل إنزيمات النوع IIS الأخرى المُستخدمة في تجميع Golden Gate: BsmBI-v2/Esp3I، وBbsI/BbsI-HF، وPaqCI (نظير AarI مع تسلسل تعرف 7 أزواج قاعدية)، وSapI/BspQI/BspQI-HF (مع تسلسل تعرف 7 أزواج قاعدية وامتدادات 3 أزواج قاعدية). س: ما هي إنزيمات التقييد المُستخدمة في تجميع GoldenBraid؟ ج: BsaI هو أحد إنزيمات النوع IIS المُستخدمة في هذه الطريقة. تقدم شركة NEB أيضًا نسخة مُهندسة عالية الدقة من هذا الإنزيم، BsaI-HF®v2، والتي تتميز بميزة إضافية وهي كونها مُؤهلة لتوفير الوقت (حيث يمكنها هضم الحمض النووي في غضون 5-15 دقيقة ويمكن هضمها بأمان طوال الليل) وتُظهر نشاطًا نجميًا مُنخفضًا. يعمل BsaI-HFv2 في محلول CutSmart®، كما هو الحال مع إنزيم T4 DNA Ligase (وهو أيضًا جزء من سير عمل GoldenBraid) الذي يكون نشطًا وظيفيًا بنسبة 100% في هذا المحلول، عند إضافة 1 ملي مول من ATP إلى التفاعل. تشمل إنزيمات النوع IIS الأخرى المستخدمة في GoldenBraid كلاً من BsmBI-v2/Esp3I وBtgZI وBbsI/BbsI-HF وPaqCI (نظير AarI مع تسلسل تعرف مكون من 7 أزواج قاعدية). المرجع: GoldenBraid 2.0: إطار عمل شامل لتجميع الحمض النووي في علم الأحياء التركيبي النباتي. س: متى يُصبح النشاط النجمي مصدر قلق؟ ج: يُعدّ النشاط النجمي مصدر قلق إذا كان ظهور نطاقات إضافية قد يؤدي إلى سوء تفسير النتائج في إجراءات تحديد النمط الجيني وتحليل الطفرات. يمكن أن يُحفّز التصميم التجريبي النشاط النجمي. من المرجح أن تحتوي أحجام التفاعل الصغيرة على تركيزات من الجلسرين تبلغ 5% أو أكثر، وهي حالة معروفة بزيادة النشاط النجمي. يحدث تركيز جلسرين بنسبة 5% عند إعداد هضم مزدوج في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر باستخدام 1 ميكرولتر من كل إنزيم. من المرجح أن تُولّد عمليات الهضم التي تستمر طوال الليل نشاطًا نجميًا. للحصول على نصائح حول تجنب النشاط النجمي، يُرجى النقر هنا. س: كم عدد النيوكليوتيدات التي يجب إضافتها بجوار موقع التعرف على إنزيم التقييد للحصول على قطع فعال؟ ج: بروتوكول هضم إنزيم التقييد: القطع بالقرب من نهاية الحمض النووي. س: ما هي إنزيمات التقييد من NEB التي تأتي مزودة بصبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X)؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF ومعظم إنزيمات التقييد غير HF من NEB تأتي مزودة بصبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X). الإنزيمات المقيدة غير HF التي تأتي مع الصبغة الأرجوانية هي: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI Sali XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * يتم أيضًا توفير جميع إنزيمات تقييد HF مع تحميل الجل الصبغ، الأرجواني (6X) س: هل يمكنك معرفة ذلك س: ما هي تفاصيل استبدال الألبومين البقري (BSA) بالألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ شركة NEB أن تُعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1، وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1، وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونعتقد أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونُقدّم هذا التحسين بنفس السعر. س: ما هي الاختلافات بين BsmBI-v2 ونظيره Esp3I؟ ج: BsmBI-v2 هو إنزيم تقييد من النوع IIS يتطلب حضانة عند 55 درجة مئوية، ويُزوّد ​​بمحلول NEBuffer r3.1. إنزيم Esp3i هو نظير متماثل لإنزيم BsmBI-v2، ويتطلب حضانة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، ويُرفق مع محلول rCutSmart Buffer™ (يحتوي rCutSmart على أكثر من 210 إنزيمات تقييد). يُستخدم كلا الإنزيمين في عملية تجميع Golden Gate. س: هل صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) أو صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) الخالية من SDS متوافقة مع أصباغ ربط الحمض النووي الأخرى مثل SYBR® وGelRed™ أثناء عملية الفصل الكهربائي الهلامي؟ ج: نظرًا لأن أصباغ ربط الأحماض النووية عالية الألفة قد تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُنصح بشدة بتلوين الهلام بصبغات SYBR أو GelRed بعد الفصل. مع ذلك، يمكن أيضًا استخدام هذه الأصباغ كأصباغ مُسبقة الصب (داخل هلام الأغاروز). نظرًا لأن صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) تحتوي على تركيز أعلى في SDS، فقد يُلاحظ بعض التداخل عند استخدام SYBR أو GelRed كأصباغ مُسبقة الصب. عند استخدام هذه الأصباغ كأصباغ مُسبقة الصب، توصي شركة NEB باستخدام صبغة تحميل الجل البنفسجية، الخالية من SDS (6X) (NEB #B7025S) بدلاً منها. يُرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام أصباغ SYBR كأصباغ مُسبقة الصب: قلل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 250-500 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من أصباغ SYBR في الجل المُسبق الصب. هذه الأصباغ أكثر حساسية من بروميد الإيثيديوم. قد يتسبب التحميل الزائد في ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. في حال استخدام صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) B7024S، استخدم محلول TBE بدلاً من محلول TAE، حيث يزداد تداخل SDS عند استخدام محلول TAE (في الجل وكسائل تشغيل). استخدم أصباغ SYBR وفقًا لتوصيات الشركة المُصنّعة: أضف صبغة SYBR إلى محلول TBE أولاً، ثم أضف مزيج صبغة SYBR/TBE إلى محلول الأغاروز المُذاب. يُفضّل الانتظار لبضع دقائق قبل إضافة صبغات SYBR إلى الأغاروز المنصهر. تُعطي إضافتها إلى محلول أغاروز مُبرّد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) نتائج أفضل. يُرجى دائمًا تشغيل هلام أغاروز مُحضّر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج رديئة. يُرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام صبغات GelRed كصبغات مُسبقة الصب: قلّل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 60 إلى 125 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من صبغة GelRed في الهلامات مُسبقة الصب. هذه الصبغة أكثر حساسية من EtBr. قد يتسبب التحميل الزائد في ظهور حزم غير واضحة أو مُشوّهة. يُفضّل الانتظار لبضع دقائق قبل إضافة صبغة GelRed إلى الأغاروز المنصهر. تُعطي إضافتها إلى محلول أغاروز مُبرّد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) نتائج أفضل. يُرجى دائمًا تشغيل هلام أغاروز مُحضّر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الجل ستؤدي إلى نتائج ضعيفة. SYBR® علامة تجارية مسجلة لشركة Life Technologies Corporation، وGelRed™ علامة تجارية لشركة Biotium.