مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R0745S، PaqCI®

تمت إعادة صياغة PaqCI باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10211228. الفئات ذات الصلة: إنزيمات القطع المحددة، تطبيقات PR، حلول الاستنساخ والأتمتة عالية الإنتاجية، مواصفات تجميع NEBridge® Golden Gate، تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، مضاف إليه مُنشِّط PaqCI، يُحضن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™: 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 10%، NEBuffer™ r2.1: 100%، NEBuffer™ r3.1: 10%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف B: محلول التخزين : 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 300 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار DTT، 500 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. تعطيل بالحرارة عند 25 درجة مئوية، ثم عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: تتأثر بالتداخل. الأسئلة الشائعة : س: ما هي إنزيمات التقييد المستخدمة في تجميع Golden Gate؟ ج: تجميع Golden Gate هو طريقة استنساخ فعالة في أنبوب واحد تعتمد على إنزيمات التقييد من النوع IIS التي تقطع خارج مواقع التعرف الخاصة بها وتترك نهايات بارزة من 3 أو 4 قواعد. يُعد BsaI أكثر إنزيمات النوع IIS استخدامًا في تجميع Golden Gate. كما تقدم NEB نسخة مُهندسة عالية الدقة من هذا الإنزيم، BsaI-HF®v2، والتي تتميز بميزة إضافية وهي أنها مؤهلة لتوفير الوقت (يمكنها هضم الحمض النووي في غضون 5-15 دقيقة أو طوال الليل دون تحلل الحمض النووي) وتُظهر نشاطًا نجميًا منخفضًا بشكل كبير. تشمل إنزيمات النوع IIS الأخرى المستخدمة في تجميع Golden Gate: BsmBI-v2/Esp3I، وBbsI/BbsI-HF، وPaqCI (نظير AarI مع تسلسل تعرف مكون من 7 أزواج قاعدية)، وSapI/BspQI/BspQI-HF (مع تسلسل تعرف مكون من 7 أزواج قاعدية ونهايات بارزة مكونة من 3 أزواج قاعدية). س: ما هي إنزيمات التقييد المستخدمة في تجميع GoldenBraid؟ ج: BsaI هو أحد إنزيمات النوع IIS المستخدمة في هذه الطريقة. كما توفر NEB نسخة مُهندسة عالية الدقة من هذا الإنزيم، BsaI-HF®v2، والتي تتميز بميزة إضافية وهي كونها مؤهلة لتوفير الوقت (يمكنها هضم الحمض النووي في غضون 5-15 دقيقة ويمكن هضمها بأمان طوال الليل) وتُظهر نشاطًا نجميًا منخفضًا. يعمل إنزيم BsaI-HFv2 في محلول CutSmart®، وكذلك إنزيم T4 DNA Ligase (وهو جزء من عملية GoldenBraid) الذي يكون نشطًا بنسبة 100% في هذا المحلول عند إضافة 1 ملي مول من ATP إلى التفاعل. تشمل إنزيمات النوع IIS الأخرى المستخدمة في GoldenBraid: BsmBI-v2/Esp3I، وBtgZI، وBbsI/BbsI-HF، وPaqCI (نظير AarI ذو تسلسل تعرف مكون من 7 أزواج قاعدية). المرجع: GoldenBraid 2.0: إطار عمل شامل لتجميع الحمض النووي في علم الأحياء التركيبي النباتي. س: متى يُصبح النشاط النجمي مصدر قلق؟ ج: يُصبح النشاط النجمي مصدر قلق إذا كان ظهور نطاقات إضافية قد يُؤدي إلى سوء تفسير النتائج في إجراءات تحديد النمط الجيني وتحليل الطفرات. قد يُؤدي تصميم التجربة إلى زيادة النشاط النجمي. من المرجح أن تحتوي أحجام التفاعل الصغيرة على تركيزات من الجلسرين بنسبة 5% أو أكثر، وهي حالة معروفة بزيادة النشاط النجمي. يُلاحظ تركيز 5% من الجلسرين عند تحضير تفاعل هضم مزدوج في حجم 20 ميكرولتر باستخدام 1 ميكرولتر من كل إنزيم. يزداد احتمال ظهور نشاط غير مرغوب فيه في تفاعلات الهضم التي تُجرى طوال الليل. للحصول على نصائح حول تجنب هذا النشاط، يُرجى النقر هنا. س: لماذا لا يقطع إنزيم PaqCI الحمض النووي بشكل كامل؟ ج: إنزيم PaqCI يتطلب مواقع تعرف متعددة لإتمام عملية الهضم. لذلك، أضافت شركة NEB مُنشط PaqCI الذي يُمكن إضافته إلى التفاعل بنسبة 1:1 (أي 1 ميكرولتر من الإنزيم إلى 1 ميكرولتر من مُنشط PaqCI). يُرجى ملاحظة أنه في تفاعلات تجميع Golden Gate، تختلف كمية مُنشط PaqCI حسب عدد القطع التي يتم تجميعها. يُرجى زيارة إرشادات استخدام تجميع Golden Gate مع PaqCI لمزيد من المعلومات. س: هل يُمكنكم إخباري المزيد عن استبدال الألبومين البقري (BSA) بالألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على BSA (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونعتقد أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر. س: بالنسبة لتجميع Golden Gate، كم عدد أزواج القواعد التي يجب أن تحتوي عليها مُدخلات التضخيم حول موقع تقييد PaqCI؟ ج: يجب أن تحتوي مُدخلات التضخيم على قواعد مُحيطة من الطرف 5' ومواقع تقييد PaqCI في كلا طرفي المُضخّم بالاتجاه الصحيح. نوصي بإضافة 6 قواعد محيطة عند الطرف 5' للبادئات لتحقيق أفضل ارتباط لإنزيم PaqCI، وقطع الحمض النووي، وكفاءة تجميع Golden Gate. تتجاوز هذه التوصية المكونة من 6 أزواج من القواعد أي تفضيلات أخرى معروفة لطول الطرف بالنسبة لهذا الإنزيم، وذلك لأن بروتوكولات تجميع Golden Gate تتطلب أقصى نشاط للإنزيم من أجل التجميع الفعال.