نيو إنجلاند بيولابس، R3104M، HindIII-HF®

تمت إعادة صياغة إنزيم HindIII-HF باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10119499. الفئات ذات الصلة: إنزيمات القطع المحددة HM، إنزيمات القطع المحددة عالية الدقة (HF®)، إنزيمات القطع المحددة الموفرة للوقت. التطبيقات: الاستنساخ السريع: تسريع عمليات الاستنساخ باستخدام كواشف من NEB. مواصفات هضم إنزيم القطع : تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار تريس-أسيتات، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 10%، NEBuffer™ r2.1: 100%، NEBuffer™ r3.1: 10%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف B، محلول التخزين : 300 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، 500 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. تعطيل بالحرارة عند 25 درجة مئوية، ثم عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: غير حساسة. الأسئلة الشائعة : س: متى يجب عليّ اختيار نسخة HF من الإنزيم؟ ج: تتمتع نسخة HF من الإنزيم بنفس خصوصية القطع التي يتمتع بها الإنزيم الأصلي، ويجب اختيارها إذا كان النشاط النجمي مصدر قلق أو إذا كان المحلول المنظم الموصى به أكثر ملاءمة للهضم المزدوج أو أي بروتوكول متعدد الخطوات. لا يوجد أي عيب في استخدام نسخة HF. س: متى يكون النشاط النجمي مصدر قلق؟ ج: يكون النشاط النجمي مصدر قلق إذا كان ظهور نطاقات إضافية قد يؤدي إلى سوء تفسير النتائج في إجراءات تحديد النمط الجيني وتحليل الطفرات. يمكن أن يعزز التصميم التجريبي النشاط النجمي. من المرجح أن تحتوي أحجام التفاعل الصغيرة على تركيزات من الجلسرين بنسبة 5% أو أكثر، وهي حالة معروفة بزيادة النشاط النجمي. يُلاحظ تركيز 5% من الجلسرين عند تحضير تفاعل هضم مزدوج في حجم 20 ميكرولتر باستخدام 1 ميكرولتر من كل إنزيم. يزداد احتمال ظهور نشاط غير مرغوب فيه عند الهضم طوال الليل. للحصول على نصائح حول تجنب هذا النشاط، يُرجى النقر هنا. س: لماذا يختلف المحلول المنظم الموصى به لنسخة HF من الإنزيم عن المحلول المنظم الموصى به للإنزيم الأصلي؟ ج: في كثير من الحالات، يؤدي تغيير الأحماض الأمينية المشحونة في جين إنزيم القطع إلى تغييرات في تفضيل المحلول المنظم. قد تكون هذه التغييرات كبيرة. على سبيل المثال، يتطلب إنزيم SalI الأصلي استخدام NEBuffer r3.1، وهو محلول منظم ذو قوة أيونية عالية. بينما يعمل إنزيم SalI-HF بكفاءة في NEBuffer r2.1 و rCutSmart Buffer™، وهما محلولان منظمان ذوا قوة أيونية متوسطة. س: متى يجب عليّ اختيار نسخة High Fidelity (HF®) من الإنزيم؟ ج: يتمتع إنزيم HF بنفس خصوصية القطع التي يتمتع بها الإنزيم الأصلي، ويُنصح باختياره إذا كان النشاط النجمي مصدر قلق، أو إذا كان المحلول المنظم الموصى به، CutSmart®، أكثر ملاءمة للهضم المزدوج أو أي بروتوكول آخر متعدد الخطوات. في بعض الحالات، قد تختلف إنزيمات HF في درجة حرارة (أو مدة) تعطيلها بالحرارة، وتحملها للملوحة، وخصائص مثيلتها (نادرًا). تعرف على المزيد حول إنزيمات التقييد عالية الدقة. س: كيف يتم قياس تحسن دقة إنزيمات التقييد HF؟ ج: يُقاس النشاط النجمي باستخدام مؤشر الدقة (FI). يمكن مقارنة مؤشر الدقة لإنزيم التقييد الأصلي مباشرةً بنظيره المُعدَّل HF. س: ما هو مؤشر الدقة (FI)؟ ج: يُعرَّف مؤشر الدقة (FI) بأنه نسبة الحد الأقصى لكمية الإنزيم التي لا تُظهر أي نشاط نجمي إلى الحد الأدنى من الكمية اللازمة للهضم الكامل في موقع التعرف الخاص بأي إنزيم تقييد معين. تُترجم قيمة مؤشر الدقة (FI) إلى الحد الأدنى من الوحدات اللازمة لإنتاج نشاط فائق. يمكن أن تتأثر قيمة مؤشر الدقة بالركيزة والمحلول المنظم والمواد المضافة مثل الجلسرين. يشرح المرجع التالي كيفية تحديد مؤشر الدقة. هوا وي وآخرون، "يوفر مؤشر الدقة قياسًا كميًا منهجيًا للنشاط الفائق لإنزيمات قطع الحمض النووي"، مجلة أبحاث الأحماض النووية، 2008، المجلد 36، العدد 9: e50. س: هل يمكن أن يكون تغيير تفضيل المحلول المنظم لإنزيم HF مفيدًا؟ ج: جميع إنزيمات قطع الحمض النووي HF مزودة بمحلول منظم rCutSmart®. عادةً ما يكون لإنزيمات HF محلول منظم أمثل مختلف عن الإنزيم الأصلي؛ وهذا قد يكون مفيدًا عند تصميم تجارب الهضم المزدوج. تم اختيار محلول rCutSmart كمحلول منظم موصى به لإنزيمات HF لأنه يُظهر أعلى مستوى من توافق الإنزيم مع نظام محاليل NEB المنظمة. س: هل سينتج إنزيم HF نشاطًا فائقًا مرتفعًا عند استخدامه في محلول منظم غير الموصى به؟ ج: تم اختبار نشاط الإنزيم النجمي على نطاق واسع في جميع محاليل NEBuffers التي أظهرت نشاطًا إنزيميًا بنسبة 50% على الأقل. ينخفض ​​نشاط الإنزيم النجمي بشكل ملحوظ مقارنةً بنشاط الإنزيم الطبيعي في جميع محاليل NEBuffers. مع ذلك، نوصي باستخدام محلول التفاعل المُقترح كلما أمكن، لأنه في بعض الحالات قد يظل النشاط النجمي مُشكلاً في ظل ظروف قاسية عند استخدام محاليل غير مُوصى بها. س: ما معنى أن يكون الإنزيم مؤهلاً لتقنية Time-Saver™؟ ج: الإنزيمات المؤهلة لتقنية Time-Saver™ تهضم وحدة الركيزة في غضون 5-15 دقيقة في ظل ظروف التفاعل المُوصى بها، ويمكن استخدامها بأمان في عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة. س: ماذا يُشير إليه اختصار HF® بعد اسم إنزيم التقييد؟ ج: يُشير HF® إلى الدقة العالية. العديد من إنزيمات التقييد الداخلية قادرة على قطع تسلسلات مُشابهة، ولكنها ليست مُطابقة، لتسلسل التعرف المُحدد لها. يُطلق على هذه الخصوصية المُعدلة أو المُخففة اسم النشاط النجمي. تم تصميم إنزيمات القطع عالية الدقة (HF) لتقطع بدقة أعلى من الإنزيم الطبيعي، مما يقلل من نشاطها غير المرغوب فيه. استُخدمت تقنيات فحص بتركيزات متزايدة من الجلسرين، ووقت تفاعل أطول، وتركيز عالٍ من الإنزيم لتحديد الإنزيمات التي توفر أعلى دقة في ظل ظروف متنوعة. بالإضافة إلى ذلك، تُزود جميع إنزيمات HF بمحلول rCutSmart Buffer™، بالإضافة إلى قارورة مجانية من صبغة التحميل البنفسجية. تعرّف على المزيد حول إنزيمات القطع عالية الدقة هنا. س: هل يجب عليّ تحضير عملية الهضم باستخدام إنزيمات Time-Saver™ لمدة 5-15 دقيقة؟ هل يمكنني الهضم لفترة أطول؟ ج: تتميز إنزيمات Time-Saver™ من NEB بسرعة عملها (5-15 دقيقة)، كما أنها مصممة ومؤهلة لتحمل عمليات الهضم طوال الليل دون إتلاف الحمض النووي. س: اختبرت إنزيم القطع الخاص بكم على الحمض النووي الموصى به من NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي تؤثر على نشاط الإنزيم. قد تُثبط الأملاح الموجودة في التفاعل إنزيمات القطع النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات التركيز الملحي العالي). قد تُؤدي إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي إلى محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الأملاح، والتي قد تنتقل إلى التفاعل وتُثبط نشاط الإنزيم. لتجنب ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المُضاف إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. يُمكن تحقيق ذلك بتعديل إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: هل يُمكن تخزين صبغة تحميل الجل، بنفسجي 6X (B7024) في درجات حرارة منخفضة؟ ج: درجة حرارة التخزين المُوصى بها لصبغة تحميل الجل، بنفسجي 6X، هي درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). عادةً، قد يترسب كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) من المحلول عند تخزين الصبغة في درجات حرارة منخفضة. يمكن التخلص من هذا الراسب الطفيف بترك القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة، أو بتسخينها برفق لمدة 10 دقائق. رجّ القارورة عدة مرات قبل الاستخدام لإعادة المحلول إلى تجانسه. س: ما هي إنزيمات التقييد من NEB التي تأتي مع صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X)؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF ومعظم إنزيمات التقييد غير HF من NEB تأتي مع صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X). الإنزيمات المقيدة غير HF التي تأتي مع الصبغة الأرجوانية هي: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI Sali XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * يتم أيضًا توفير جميع إنزيمات تقييد HF مع تحميل الجل صبغ، بنفسجي (6X) س: هل هذا هل هذا الإنزيم حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: لا. هذا الإنزيم غير حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات. للحصول على أحدث المعلومات حول حساسية المثيلة، يُرجى زيارة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل تُوفر NEB أي إنزيمات تقييد خالية من BSA و/أو خالية من المكونات الحيوانية لتسلسل البلازميدات في تطوير لقاحات mRNA؟ ج: نعم، قامت NEB بتطوير بعض إنزيمات التقييد (بما في ذلك BspQI، وهو نظير SapI) بدون مكونات حيوانية المنشأ، ولا يحتوي تركيبها النهائي على BSA. بالإضافة إلى ذلك، لدينا العديد من إنزيمات التقييد المتاحة بدون BSA أو أي مكونات حيوانية المنشأ في تركيبها النهائي. تتضمن هذه القائمة: BbsI-HF، BsaI-HFv2، BspQI (نظير LguI)، BspQI-HF (متوفر الآن بدرجة GMP*)، ClaI، HindIII-HF، PacI، SapI، SpeI، SwaI، XbaI، XhoI، XmnI. يمكن تحضير إنزيمات أخرى حسب الطلب. يُرجى الاستفسار هنا. * "درجة GMP" و"درجة GMP" مصطلحان تجاريان تستخدمهما شركة NEB لوصف المنتجات المصنعة أو النهائية في منشأة Rowley التابعة لها. صُممت منشأة Rowley لتصنيع المنتجات وفقًا لبنية تحتية وضوابط عمليات أكثر صرامة لتحقيق مواصفات منتجات أكثر دقة وتلبية متطلبات العملاء. تُصنع المنتجات في منشأة Rowley التابعة لشركة NEB وفقًا لمعايير نظام إدارة الجودة ISO 9001 وISO 13485. مع ذلك، لا تقوم NEB حاليًا بتصنيع أو بيع المنتجات المعروفة باسم المكونات الصيدلانية الفعالة (APIs)، كما أنها لا تُصنّع منتجاتها بما يتوافق مع جميع لوائح ممارسات التصنيع الجيدة الحالية. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من الألبومين البقري المصل (BSA) إلى الألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري المصل (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المؤتلف (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المؤتلف. ونعتقد أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر. س: هل صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X) أو صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X)، بدون SDS متوافقة مع أصباغ ربط الحمض النووي الأخرى مثل SYBR® وGelRed™ أثناء الفصل الكهربائي الهلامي؟ ج: نظرًا لأن الأصباغ ذات الألفة العالية لربط الأحماض النووية قد تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُنصح بشدة بتلوين الهلامات بعد الفصل باستخدام أصباغ SYBR أو GelRed. مع ذلك، يمكن استخدام هذه الأصباغ أيضًا كأصباغ مُسبقة الصب (داخل هلام الأغاروز). نظرًا لأن صبغة تحميل الهلام، البنفسجية (6X) تحتوي على تركيز أعلى من SDS، فقد يُلاحظ بعض التداخل عند استخدام SYBR أو GelRed كأصباغ مُسبقة الصب. عند استخدام هذه الأصباغ كأصباغ مُسبقة الصب، توصي NEB باستخدام صبغة تحميل الهلام، البنفسجية، الخالية من SDS (6X) (NEB #B7025S) بدلاً منها. يُرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام أصباغ SYBR كأصباغ مُسبقة الصب: قلل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 250 إلى 500 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من أصباغ SYBR في الهلامات المُسبقة الصب. هذه الأصباغ أكثر حساسية بكثير من بروميد الإيثيديوم. قد ينتج تداخل الشرائط أو تلطيخها عن التحميل الزائد. عند استخدام صبغة تحميل الجل، البنفسجي (6X) B7024S، استخدم محلول TBE بدلاً من محلول TAE، حيث يزداد تداخل SDS عند استخدام محلول TAE (في الجل وكسائل تشغيل). استخدم أصباغ SYBR وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة: أضف صبغة SYBR إلى محلول TBE أولاً، ثم أضف مزيج صبغة SYBR/TBE إلى محلول الأجاروز المنصهر. يُفضل الانتظار بضع دقائق قبل إضافة أصباغ SYBR إلى الأجاروز المنصهر. تُعطي إضافتها إلى محلول أجاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) نتائج أفضل. قم دائمًا بتشغيل جل أجاروز مُحضر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الجل ستؤدي إلى نتائج رديئة. يرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام صبغات GelRed كصبغات مُسبقة الصب: قلل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 60-125 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من صبغة GelRed في الهلامات مُسبقة الصب. هذه الصبغة أكثر حساسية من بروميد الإيثيديوم. قد يؤدي التحميل الزائد إلى ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. يُفضل الانتظار بضع دقائق قبل إضافة صبغة GelRed إلى الأغاروز المُذاب. تُعطي إضافتها إلى محلول أغاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) نتائج أفضل. قم دائمًا بتشغيل هلام أغاروز مُحضر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج رديئة. SYBR® علامة تجارية مسجلة لشركة Life Technologies Corporation، وGelRed™ علامة تجارية لشركة Biotium.